基于CRISPR/dCas9技术的肝癌ctDNA预后相关甲基化标志物的功能机制研究

The valid blood-based markers for the prognosis prediction of hepatocellular carcinoma (HCC) are still lacking. Circulating tumor DNA (ctDNA), which carries the same molecular genetic and epigenetic information with the primary tumors, may act as a noninvasive “liquid biopsy” marker for the diagnosis and prognosis of cancers. In our previous study, we have found that there are detectable prognosis-associated ctDNA methylation markers in the plasma of HCC patients. The prediction model based on these markers can accurately distinguish patients with different prognosis, but the underlying function mechanism is not clear. In this project, we plan to perform multiple molecular cell biological and epigenetic experiments, including CRISPR/dCas9-based methylation editing, in a variety of cell and animal models, to evaluate the clinical significance of these ctDNA methylation markers and downstream genes in HCC tissues. We try to reveal the regulation of these markers on downstream genes and signal pathways. We also plan to observe the effect on HCC cells phenotype and molecular changes after methylation editing. We hope to elucidate the function mechanism of these prognosis-associated methylation markers and provide potential targets for future gene therapy, as well as the evidence in carcinogenesis and developments of HCC.

肝细胞癌（HCC）缺乏有效的预后预测标志物，循环肿瘤DNA（ctDNA）携带有与原发肿瘤一致的分子遗传信息，是理想的无创性液体活检标志物。我们在前期研究中已经发现HCC患者血浆中存在与预后密切相关的ctDNA甲基化标志物，基于这些标志物建立的预测模型能准确的区分不同预后的患者，但是其功能机制尚不明确。本研究拟在此基础上，采用一系列分子细胞生物学和表观遗传学的实验方法，采用多种细胞和动物模型，利用CRISPR/dCas9系统特异性DNA甲基化编辑功能，从细胞功能和分子机制上，明确肝癌ctDNA预后相关的甲基化标志物及下游基因在肝癌组织中的表达及其临床意义，揭示这些标志物对相关基因的调控作用，探讨改变这些标志物甲基化水平以后相关基因的表达变化和对肝癌细胞表型的影响，从而阐明这些标志物影响肝癌预后的具体机制，有望发现潜在的治疗新靶点，为进一步明确肝癌的发生发展分子机制和基因治疗提供有力的科学证据

我们前期在肝癌患者血浆ctDNA中发现一组与患者预后有关的标志物，并建立了肝癌预后预测模型。但是对其影响肝癌预后的机制尚不清楚，到底哪些标志物是因为统计学的原因进入预后预测模型，哪些是真正能够影响肝癌生物学行为的，还需要进一步研究。在本研究中，我们筛选出与肝癌预后关系最密切的cg23461741位点及其参考基因SH3PXD2A，通过CRISPR-Cas9技术，发现改变cg23461741位点甲基化水平后可影响SH3PXD2A的表达变化，细胞表型实验提示SH3PXD2A在肝癌发生发展中起到类似癌基因的作用，其分子机制有可能是促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、减弱细胞间黏附促进转移。此外，还发现了结直肠癌特异性的ctDNA甲基化分子标签，位点cg10673833及其参考基因MYO-1G是有效的结直肠癌检测标志物。以上结果说明ctDNA甲基化标志物是消化道肿瘤有效的诊断和预后预测手段，其作用主要是通过调控其下游的相应基因表达实现的。