设计、合成远红光调控的CRISPR/dCas9装置及其应用研究

Recently, CRISPR/dCas9 system has provided a new tool to activate or repress the transcription of target genes in prokaryotes and eukaryotes. However, uncontrollable regulation of this system can lead to non-specific gene expression. In this regard, we use synthetic biology and optogenetic approaches to develop far-red light mediated CRISPR/dCas9 devices with good biocompatibility, strong tissue penetration and high tunability to achieve traceless, high spatiotemporal and precise regulation of gene expression. First of all, on the basis of our previously developed STING-dependent far-red light (FRL) activated CRISPR/dCas9 effector system, we rationally design and create FRL-activated CRISPR/dCas9 devices based on the transcription factor BldD and explore transgene expression kinetics of these devices. Secondly, the photoactivatable devices are uploaded into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) enabling to promote differentiation of hiPSCs into dopamine neurons by spatiotemporally upregulating the neural transcription factor. This approach will provide a new therapeutic strategy for regenerative medicine research and clinical application.

近年来，CRISPR/dCas9系统作为新一代基因表达调控工具在原核和真核生物中实现了对基因的转录激活或抑制，但是该技术的不可控会导致基因表达调控的非特异性。针对该问题，本项目结合合成生物学和光遗传学技术，开发一种安全、组织穿透性强的人工可控新型远红光调控CRISPR/dCas9装置，通过远红光实现无痕迹、高度时空特异性、精准调控基因的表达。首先，在初步构建基于STING的远红光调控CRISPR/dCas9系统基础上，理性设计、构建基于BldD的远红光调控CRISPR/dCas9的装置，研究其调控基因表达的动力学特征；其次，将该装置上载到人诱导性多能干细胞，通过远红光时空特异性精准调控神经转录因子的表达，在体外实现多巴胺神经细胞的分化。本项目的实施，将为再生医学研究和临床治疗提供一种新方法和新策略。

近年来，CRISPR/dCas9系统作为新一代基因表达调控工具在原核和真核生物中实现了对基因的转录激活或抑制，在治疗人类疾病方面不断展现出巨大潜力，但是该技术的不可控会导致基因表达调控的非特异性。针对该问题，本项目结合合成生物学和光遗传学技术，开发了一种人工可控的，具有非侵入性、高度时空特异性以及强组织穿透性等特点的新型远红外光调控CRISPR/dCas9基因转录激活装置。首先，在初步构建基于STING的远红光调控CRISPR/dCas9系统基础上，将来自于红细菌中响应远红光的蛋白BphS、链球菌中的转录因子BldD、酿脓链球菌中的dCas9蛋白等经人工设计组装成远红光调控的CRISPR-dCas9内源基因转录装置，在远红光照射下，经sgRNA/dCas9的精准定位，能实现操控靶标基因表达的目的，在远红光照射下能调控内源基因ASCL1转录表达达440倍。其次，在细胞水平测试了该装置的动力学特征，研究证明该装置在远红光的诱导下，激活内源基因具有很好的光照强度和时间的依赖性、广谱性、可逆性以及高度的时空特异性。最后，将该装置上载到诱导性多能干细胞，通过远红光能调控内源神经转录因子NEUROG2的表达，将诱导性多能干细胞成功分化为多巴胺神经细胞。本项目的实施，将为再生医学研究和临床治疗提供一种新方法和新策略。