基于LPS-TLR4信号通路介导HLA-B27相关前葡萄膜炎易感家族发病机制的基础研究

HLA-B27 associated anterior uveitis has a significant familial aggregation, sereous symptoms, a high recurrence rate and serous complications.The different susceptivity among the HLA-B27 positive individuals in the same family remains unknown.Study at home and abroad suggest that the HLA-B27 associated anterior uveitis is related to the gram-negative bacterial infection and Toll-like receptor 4-mediated inflammation-related signaling pathways. Our previous work demonstrated high of Toll-4 in the peripheral blood mononuclear cells of HLA-B27 positive acute anterior uveitis patients and iris macrophages of endotoxin-induced uveitis rats, and the importance of activation of TLR4-MyD88-NF-κB pathway in the etiology of anterior uveitis. Through comparing HLA-B27 positive families with acute anterior uveitis peripheral blood mononuclear cells with the normal control group after LPS stimulation by gene chip technology and siRNA intereing, we hope found the key genes in the upstream of LPS-TLR4 signaling pathway, and provide a theoretical basis in gene therapy for the HLA-B27 positive anterior uveitis.

HLA-B27阳性前葡萄膜炎除具有明显的家族聚集性、症状重、复发率高、合并全身疾病等特点外，还明显表现为家族内个体易感性的差异。目前国内外研究认为葡萄膜炎的发生可能和G-细菌感染后TLR-4介导的炎症信号传导通路激活相关。我们在前期大鼠EIU虹膜巨噬细胞及HLA-B27阳性前葡萄膜炎患者外周血单核细胞均发现TLR-4高表达，并证实TLR4-MyD88-NF-κB传导途径激活在前葡萄膜炎发病中的重要性。为探索同一家族个体间发病的差异性，我们拟通过基因芯片技术对5个HLA-B27相关前葡萄膜炎易感家族(均有HLA-B27阳性未发病及发病缓解期、HLA-B27阴性未发病成员）外周血单核细胞LPS刺激前后基因表达差异的检测,功能分析, siRNA干扰验证，以期揭示HLA-B27阳性前葡萄膜炎位于LPS-TLR4传导通路重要的致病基因，为其功能研究及基因治疗提供理论依据。

通过对HLA-B27抗原表达阳性的家族发病与不发病者外周血单核细胞基因表达谱的比较分析，初步探讨其差异基因的表达、功能及关键的生物学信息转导通路，以期从基因水平上揭示HLA-B27相关前葡萄膜炎的发病机制。选择首都医科大学附属北京朝阳医院眼科门诊HLA-B27阳性的4个家庭，每个家庭选取一名HLA-B27阳性AAU患者及一名HLA-B27阳性不发病直系亲属，抽取静脉血并分离单核细胞。获取的单核细胞各自平均分为刺激组和非刺激组。刺激组给予1ug/mL LPS，非刺激组给予1ug/mL PBS。患者刺激组为A2组，非刺激组为A1组。亲属刺激组为B2组，非刺激组为B1组。运用基因表达谱芯片技术检测差异表达基因，运用基因功能富集分析（GO），信号通路分析，全局信号转导网络（Signal-Net）及共表达调控网络（Gene-Rel-Net）对筛选出的差异基因之间的调控作用进行深入分析。实时定量PCR（qRT-PCR）验证芯片结果。ELISA检测细胞上清液炎症相关因子水平。Affymetrix Human Gene 1.0 ST分析了LPS刺激后患者单核细胞及对照亲属单核细胞的差异基因。成对T检验验证差异表达基因，P＜0.05的基因定义为差异表达基因。最终获得801个差异表达基因，其中349个上调，452个下调。GO分析发现的重要功能包括有代谢过程，免疫及炎症反应，细胞通讯以及信号转导。信号转导通路分析发现差异基因主要参与通路包括物质代谢，细胞因子间受体相互作用，肠道免疫网络IgA生成，趋化因子信号通路以及吞噬体和溶酶体等。通过Signal-Net和Gene-Rel-Net分析获得18个网络核心位置基因，其中IRAK3基因在本实验分析中呈现与周围基因最高的关联性。qRT-PCR验证18个关键基因表达与基因芯片差异趋势相符。ELISA检测发现HLA-B27相关AAU患者外周血单核细胞较其家属在LPS刺激下分泌更高浓度的IL-6和TNF-α以及更低浓度的IL-10。IRAK-3是TOLL样受体介导炎症反应通路中的负调节因子。IRAK3可能在HLA-B27阳性AAU发病中发挥重要作用，为疾病的关键作用基因。HLA-B27相关前葡萄膜炎患者外周血单核细胞在LPS刺激下产生更显著的炎症反应，本研究为HLA-B27阳性AAU的发病机制提供新依据，为其治疗提供新的可能靶点。