线粒体炫在电子传递链中产生的位点及其检测心脏衰老的机制研究

Mitochondrial flash (Mitoflash), as an event that mainly reflects the superoxide explosion of single mitochondria in cells, plays an important role in the physiological and pathological processes of eukaryotes. Recently, it has been clear that mitoflash is closely related to mitochondrial electron transfer chain (ETC), but its reaction to some inhibitors of ETC, such as antimycin A, is inconsistent with the detection of MitoSOX, indicating that mitoflash could not reflect the production of superoxide anions at multiple sites on ETC, and should be generated at a specific ETC site. We will establish a model of permeabilized cardiomyocyte, use substrates and inhibitors of ETC, RNAi to manipulate ETC activity, confocal two-dimensional imaging to monitor mitoflash activity, uncover the specific site of mitoflash generation on ETC, and thus distinguish the superoxide detected by mitoflash from the whole superoxide detected by MitoSOX. Furtherly, we will monitor mitoflash in different models of cardiac dysfunction caused by aging or heart failure, elucidate the molecular mechanism of mitoflash in monitoring cardiac aging, and lay a theoretical foundation for the specific application of mitoflash in monitoring mitochondrial superoxide and function.

线粒体炫作为主要反映细胞单个线粒体超氧爆发的事件，在真核生物的生理过程和病理过程中具有重要的意义。最近明确线粒体炫的产生同线粒体电子传递链(ETC)密切相关，但是其对ETC某些抑制剂，如抗霉素A的反应同MitoSOX的检测不一致，表明线粒体炫不能反映ETC上多位点的超氧阴离子(O2-.)产生，应产生于某特殊位点。为此，我们将建立破膜的心肌细胞模型，利用ETC相关的呼吸底物和抑制剂、RNAi来操控ETC活性，共聚焦显微镜2维成像监测线粒体炫活性，系统研究揭示阐明线粒体炫在ETC中产生的具体位点，将线粒体炫的特异位点超氧阴离子监测同MitoSOX的整体超氧阴离子检测区分开；进一步的在衰老和衰弱导致的不同心脏功能紊乱模型中监测线粒体炫，阐明线粒体炫特异监测心脏衰老的分子机制，为线粒体炫特异性监测线粒体超氧化物和功能方面的应用奠定坚实的理论依据。

心脏作为血液循环器官，对于动物极为重要，其中线粒体占成年心肌细胞体积的40%左右，许多心脏疾病的发生都同线粒体功能异常有关。线粒体炫（Mitoflash）作为一个我国科学家发现的可以在体反应线粒体相关事件的生物指标，阐释清楚其在线粒体中产生的机制，对于它的应用和线粒体研究，特别是心肌细胞的研究具有重要的意义。我们首先通过离体心脏灌流的方式，建立了高效分离和培养的成年鼠心肌细胞的方法和皂素破膜细胞测定成年心肌细胞氧消耗（OCR）的方法，然后在过表达 mt-cpYFP 的破膜成年心肌细胞上，利用线粒体电子呼吸链（ETC）相关的呼吸底物和多种 ETC 抑制剂、结合基因沉默技术来调控ETC 各种复合物的电子传递和活性，系统的研究揭示了Mitoflash在ETC中复合物III的 Qo 位点产生，将线粒体炫的特异位点超氧阴离子监测同 MitoSOX 检测整体超氧阴离子区分开，并在心衰和衰老小鼠不同心脏功能紊乱模型中监测 Mitoflash，阐明了 Mitoflash监测心脏衰老的特异性机制。在此基础上，我们建立了成年心肌细胞体外线粒体呼吸测定的方法，为成年心肌细胞的线粒体功能研究提供了保障。此外，我们也研究了心肌线粒体质量控制关键基因Mfn2对于心脏功能的影响，提出了促进心脏疾病中的线粒体融合最安全的策略是调控融合蛋白Mfn2的理论，为心脏疾病的线粒体调控治疗指明了方向。进一步地，我们优化建立了PFA和GA联合固定细胞线粒体的方案，研究揭示了线粒体超氧导致的氧化应激影响iPS-CMs分化过程，而通过靶向线粒体抗氧化可以促进iPS-CMs的分化和发育。