线粒体网络动态调控线粒体炫及其分子机制研究

Mitochondria are highly dynamic organelles in living cells. The regulation of mitochondrial morphology and dynamics is essential for mitochondrial functions. Mitochondrial flash (mitoflash) is a highly-conserved, universal and fundamental mitochondrial activity. Mitoflash plays key role during mitochondrial metabolism and participates in various biological processes. Mitoflash also acts as a novel biomarker of mitochondrial function. In the present study, we propose to research the regulation of mitoflash by mitochondrial dynamics. First, we will detect mitoflashes in cell lines respectively with deficient molecules which are critical for mitochondrial dynamics, such as Mfn1-/- MEF (murine embryonic fibroblasts), Mfn2-/- MEF, Mfn1/Mfn2-/- MEF, Opa1-/- MEF, Drp1 knockdown HeLa cells, and Fis1-/- MEF. Then we will detect various signals including mitochondrial membrane potential, Ca2+, pH, and ROS (reactive oxygen species), using live cells imaging and confocal multiple-channels scanning. And we will also test the states of mitochondrial metabolism and function. We thus can investigate the mechanism by which mitochondrial dynamics modulates mitoflash. Furthermore, our study will indicate the roles of mitochondrial dynamics and mitoflashes in the modulation of mitochondrial functions. Our research will also imply the regulation of complex signaling network within mitochondrial matrix from a new sight.

线粒体形态调控对维持线粒体功能至关重要。线粒体炫（mitoflash）是线粒体内的基本事件，也是评价线粒体功能的指标，参与了多种生物学过程。本课题中，我们将交叉使用分子生物学、细胞生物学、生物物理学的技术手段，通过对一系列线粒体形态调控蛋白Mfn1、Mfn2、Opa1、Drp1、Fis1等的敲除或敲低，系统地研究这些分子对mitoflash的调控作用。同时结合活细胞成像和共聚焦显微镜多通道同步记录，综合检测线粒体动态变化过程中膜电位、Ca2+、pH、活性氧、mitoflash等多种信号，系统深入地阐述线粒体动态变化调控mitoflash的分子机制，探讨线粒体形态—呼吸代谢功能—mitoflash三者之间的联系。这些研究将帮助我们理解mitoflash在线粒体网络中的发生和传播机制，拓展我们对线粒体网络、线粒体功能的认识，也为研究线粒体内多信号的调控网络提供了理论基础和实验依据。

我们的研究发现：1. 线粒体外膜融合蛋白Mfn1和Mfn2的单敲除以及双敲除细胞中，mitoflash的发生频率并未改变；然而，mitoflash信号（signal mass）显著下降。调控线粒体运动的驱动蛋白Kif5b缺失后，mitoflash的频率与生物物理特性也未发生改变。这些结果说明线粒体形态的改变并不能影响mitoflash的发生。2. 当内膜融合蛋白Opa1缺失后，本底水平的mitoflash的频率发生了显著性的降低，进一步研究发现Opa1缺失引起了线粒体呼吸代谢功能的严重缺陷，从而进一步降低了mitoflash的发生频率。同时，我们使用了不依赖于线粒体代谢功能的多种刺激物都可以恢复Opa1缺陷的mitoflash的发生频率。3. 我们利用分子生物学手段分别敲低了线粒体分裂蛋白Drp1和Mff，发现细胞内的线粒体高度融合，形成一个大的整体网络，在这种全细胞网络化线粒体中，经典的mitoflash的发生频率并未改变；同时，由于线粒体高度网络化后检测灵敏度的提高，我们能够检测到信号幅度更小，时程更短的事件，并和mitoflash具有相似的物理学特性，因此我们将之命名为“Miniflash”。有意思的是，在Drp1敲低后高度网络化（hyperfussion）的线粒体中可以观测到大面积的线粒体肿胀/收缩（swelling/contraction）现象。进一步实验表明，Drp1的显性负效应突变体（dominant negative mutant）Drp1 K38A能够重复Drp1敲低后的一系列表型。.本研究中，我们系统的研究了线粒体动态变化对mitoflash的调控,首次发现了mitoflash信号的调幅机制，并总结了调控mitoflash发生的随机触发模型，即mitoflash由线粒体上离散分布的触发位点触发，这些位点的数量并不因为线粒体网络化程度发生变化而改变。