长非编码RNA新功能分子调节血管NF-κB通路的机制鉴定及应用探讨

Noncoding RNA is an important part of vascular signaling pathway. Notably, long noncoding RNAs (lncRNA) appear as novel members in vascular signaling networks. LncRNA ANRIL is a well-known susceptible gene in human coronary artery disease. We previously found that the mechanism depends on the regulation of NF-κB signaling in vascular endothelial cells (EC), indicating the important role of lncRNAs in vascular inflammatory diseases. However, the specific role of lncRNA in NF-κB signaling networks as a new regulatory layer and the its application effect needs to be further explored. We performed RNA-seq in TNFα-induced ECs and identified novel lncRNAs as potential candidates of NF-κB pathway. Bioinformatics analysis and primary experimental data indicated that 11 lncRNAs are novel functional molecules in vascular inflammation, 4 of them are downstream targets of NF-κB. This project attempts to use the established lncRNA technique platforms and clinic resources to identify the function and mechanism of these new lncRNAs, to define their specificity、targets and mechanisms. Furthermore, a novel signaling network of lncRNA, NF-κB and their targets will be established, and the possible application of the novel lncRNA targets in vascular diseases will be explored.

非编码RNA是信号传递通路的重要组成部分，长非编码RNA（lncRNA）作为血管信号网络新成员的功能值得关注。lncRNA ANRIL是已确认的冠心病易感基因，我们首先揭示了其信号机制是参与血管内皮细胞NF-κB通路的调节，提示lncRNA在血管炎症中的重要作用。然而内皮lncRNA作为一个新的调节层面在NF-κB信号网络中的作用特点及应用意义有待继续系统深入的研究。为此，我们通过内皮细胞的RNA-seq鉴定了一批TNFα诱导的lncRNA新分子。生物信息分析和初步实验发现11个lncRNA是参与血管炎症的新功能分子，其中4个定位于NF-κB下游。本申请拟利用已有的lncRNA技术平台和l临床样本，对新筛选的lncRNA继续功能机制鉴定，确定其作用特异性、调节的靶基因及相互作用分子,构建lncRNA与NF-κB及其靶分子的血管调控新网络，并探讨它们作为新靶点在疾病中的应用。

长非编码RNA（lncRNA）作为血管信号网络新成员发挥重要调控功能，本项目目标是对新筛选的NF-κB通路的lncRNA进行功能和机制鉴定，并探讨它们作为新靶点在疾病诊治中的应用。本项目发现ICR（ICAM1 -Related RNA）是最有潜力的候选分子并取得了如下重要结果：1）TNF-α、IL-1β和LPS等炎症因子均能以时间和浓度依赖的方式诱导ICR和ICAM1的表达，ICR在诱导早期（6h）表达最高，说明ICR和ICAM1为血管内皮细胞激活过程的早期应答基因；2）ICR介导了炎症因子对血管内皮细胞的激活。过表达或敲低ICR促进内皮细胞的粘附和迁移能力，但不影响细胞增殖。3）小鼠体内敲低ICR抑制动脉粥样硬化的形成。在ApoE-/-动脉粥样硬化模型小鼠中mICR在病变主动脉中表达升高，在ApoE-/-小鼠中通过尾静脉持续注射shRNA-mICR腺病毒，发现与对照组相比，shRNA-mICR组小鼠的主动脉根部管腔狭窄程度减少了24.5%，主动脉树中斑块面积比例减少了约23.3%。4）NF-κB直接结合ICR启动子区并激活ICR的转录。用siRNA敲低NF-κB中关键的p65亚基发现TNF-α对ICR的诱导被抑制，而过表达Iκ-κB则增加ICR表达。染色质免疫共沉淀实验显示p65蛋白结合到ICR启动子上多个NF-κB位点实现对ICR的转录激活。5）ICR通过正反馈机制调控NF-κB通路下游分子。TNF-α处理的内皮细胞中敲低ICR，进行RNA测序分析，发现ICR调控的下游靶基因在NF-κB与通路中非常特异而显著的富集。有趣的是，敲低ICR后细胞核内p65的蛋白水平被显著抑制。而抑制蛋白酶体活性不仅可阻止p65的降解，恢复p65水平，而且可以恢复被ICR抑制的NF-κB靶点的表达。说明ICR能够反过来促进p65的积累和活性，形成一个正反馈环来放大NF-κB信号。因此，ICR作为一种加速器，在活化的内皮细胞中放大NF-κB信号，并通过ICR/p65环阻断抑制动脉粥样硬化形成，是一个关键的早期干预新靶点。