长非编码RNA ANRIL作为内皮细胞NF-κB通路新成员的功能及机制研究

Understanding the function of long non-coding RNAs is becoming the great challenge. ANRIL is a paradigm of functional lncRNAs implicated in important human diseases including atherosclerosis and cancers by genetic studies. The known function of ANRIL is to regulate its adjacent INK4 genes in cis and thereby involved in cell cycle modulations. Our new data in endothelial cells showed basal level is required for cell cycle maintenance, however, ANRIL is markedly induced by inflammatory factor TNF-α, but not proliferation mitogen VEGF and PDGF under pathological condition. Furthermore, ANRIL demonstrated a differential regulatory effect for expression of NF-κB downstream genes as a novel component of the classic inflammatory signaling. NF-κB is a converged molecule of multiple inflammatory pathways and a critical drug target for immune diseases. Our findings suggest a new regulatory layer of lncRNAs in the pathway. This application attempts to employ approaches of cell biology and human populations to explore the targets of ANRIL in NF-κB pathway, molecular mechanism for regulation of NF-κB -ANRIL and their clinical significance in human vessel diseases. This study is of great significance for understanding the signal transduction mechanism of lncRNAs and identifying novel targets for diagnosis and treatment of immune mediated human diseases including atherosclerosis.

长非编码RNA（lncRNA）在疾病中的功能和机制研究是具有挑战性的重要课题。遗传学研究发现lncRNA ANRIL是动脉粥样硬化、肿瘤等疾病的相关基因。既往研究认为ANRIL调节细胞周期是其参与疾病的主要机制。我们探讨了ANRIL在血管内皮细胞的功能，意外发现虽然基础水平的ANRIL参与细胞周期的维持，但刺激条件下ANRIL被TNF-α/IL-1等炎症因子诱导，对细胞增殖因子不敏感。进一步发现ANRIL作为NF-κB信号系统的新成员，选择性调控其下游分子。NF-κB是血管炎症的信号汇聚点及药物干预靶点，我们的发现首次建立了NF-κB与ANRIL之间的调控关系。本申请拟继续探讨ANRIL参与NF-κB信号传递的分子机制及其靶基因，探讨NF-κB—ANRIL通路的临床意义。本研究将拓展我们对NF-κB和长非编码RNA的信号传递机制的认识，有助于鉴定动脉粥样硬化等炎症相关疾病的诊治新靶点。

冠心病是世界范围内的头号杀手。遗传学研究发现Chr9p21区域的长非编码RNA基因ANRIL（Antisense Noncoding RNA in the INK4 Locus）是主要的易感基因。然而ANRIL在冠心病病理过程中的功能及作用机制尚不清楚。由于内皮细胞的功能异常是冠心病发生的始动因素，本项目拟通过探讨ANRIL在血管内皮细胞的功能揭示其参与冠心病的机制。. 我们首先对生理条件下血管内皮细胞中ANRIL的功能进行了研究，发现血管内皮细胞基础水平ANRIL主要参与细胞增殖的调控及细胞周期的维持。.为了探究病理条件下ANRIL参与冠心病的分子机制，采用 PDGF，TNFa，LPS处理发现炎症因子会特异性上调ANRIL基因的表达，并且RNA干扰和染色质免疫共沉淀实验共同揭示NF-κB直接介导TNF-α对ANRIL基因的表达上调。RNA测序结果表明ANRIL同时调控TNF-α通路下游包括IL6和IL8等多个炎症基因的表达。冠心病人群基因表达分析结果表明ANRIL与IL6/IL8基因的表达呈显著正相关。结合已有的CHIP-seq数据，我们发现ANRIL下游多个靶基因启动子区均含有YY1的结合位点。炎性刺激下血管内皮细胞内ANRIL与转录因子YY1特异性结合，我们猜测YY1介导了ANRIL对下游炎症基因的表达调控。以IL6/IL8基因为例，靶向敲低YY1导致炎症刺激诱导的IL6/IL8基因的表达上调被明显抑制。染色质免疫沉淀实验证实YY1与IL6/IL8基因的启动子区直接结合，靶向敲低ANRIL后YY1与靶基因DNA的结合被明显抑制，提示ANRIL与YY1通过特异性结合共同参与对下游通路靶基因的表达调控。此外我们利用CHIRP实验证实ANRIL转录本与IL6/IL8启动子区YY1位点结合。上述结果提示ANRIL与YY1以及靶基因DNA三者具有特异性结合。. 本项目首次对内皮细胞中ANRIL的功能及分子机制进行了较为系统且深入的探究。首次发现病理条件TNF-α-NF-κB-ANRIL/YY1-IL6/IL8调控通路的，为冠心病的遗传学病因提供了一种可能的解释，同时也为冠心病疾病治疗及药物开发提供了全新的思路。