甲型鸭肝炎病毒2A蛋白在病毒复制和翻译过程中的作用机制研究

Duck hepatitis A virus (DHAV) is a new determined member of picornarvirus. By compared and analysed the 2A proteins of DHAV to other viruses,we have found that it has the complex structure as it retains longest coding regeion and up to three potential maturing proteins.In our previous study,we proved that the 2A1 protein of DHAV could self-cleavged in mammalian cells. So far ,the precise role about 2A protein in the process of replication and translation of duck hepatitis virus has not been cleared. In order to obtain an insight into the real role of 2A protein playing in DHAV replication and translation,we plan to construct a series of DHAV replicon mutants, which were deleted or exchanged 2A protein, on the base of the reverse genetic system of DHAV. The precise role of 2A protein in the replication and translation of DHAV will be evaluted by detecting the expression level of the report gene. Besides, we will determine some key sites which are crucial to the function of 2A protein through investigating the interaction between 2A and cellar translation initiation factors or DHAV genomic RNA. These results will provide some important clues for further exploring the regulation mechanisms of replication and translation of DHAV.

甲型鸭肝炎病毒（DHAV）是小RNA病毒家族的一名新成员，其2A蛋白的编码序列与其它已知小RNA病毒相比，表现出显著差异性，不仅其序列是最长的，其潜在的裂解蛋白也最多。我们的初步研究结果表明，鸭肝炎病毒的2A1蛋白在哺乳动物细胞中同样具有自裂解功能。 目前，关于2A蛋白及其裂解产物在鸭肝炎病毒的复制和翻译中的具体功能还不清楚。鉴于此，我们拟在前期研究基础上，利用反向遗传操作平台，运用基因缺失、替换和分子间相互作用(蛋白-蛋白，蛋白-RNA)等技术，系统研究鸭肝炎病毒2A蛋白在病毒基因组的复制、转录和蛋白表达等过程中发挥的作用。该研究将为深入研究DHAV的复制、表达及其调控机制等提供有价值的参考信息。

甲型鸭肝炎病毒（DHAV）的2A蛋白的编码序列与其它已知小RNA病毒相比，表现出显著差异性，不仅其序列是最长的，其潜在的裂解蛋白也最多。我们的初步研究结果表明，鸭肝炎病毒的2A1蛋白在哺乳动物细胞中同样具有自裂解功能。 由于，关于2A蛋白及其裂解产物在鸭肝炎病毒的复制和翻译中的具体功能还不清楚。鉴于此，我们拟在前期研究基础上，利用反向遗传操作平台，运用基因缺失、替换和分子间相互作用(蛋白-蛋白，蛋白-RNA)等技术，系统研究鸭肝炎病毒2A蛋白在病毒基因组的复制、转录和蛋白表达等过程中发挥的作用。首先DHAV的2A蛋白参照预测的2A1/2A2/2A3结构进行原核表达（2A2/2A3）并制备多抗隆抗体；其次结合WB实验和fluc串联表达实验证明在自然状态下2A蛋白可分为2A1/2A2/2A3 三个部分。第三运用了双荧光报告质粒实验证实了2A1不论在哺乳动物还是禽类细胞中均具有自我裂解功能，GFP融合表达实验还证实了2A2和2A3具有明显的核定位现象。第四利用萤火虫荧光素酶报告基因(fLuc)整体替换病毒的衣壳蛋白编码区。同时，保留了DHAV复制必需的所有蛋白酶基因和两端的非编码区，构建了DHAV复制子。荧光素酶实验表明该复制子能够在DF-1细胞中稳定复制和表达。随后在3D蛋白进行了GDD序列的突变，结果显示该复制子丧失了转录功能。第五在DHAV复制子的基础上，我们分别将2A蛋白进行逐个缺失和组合缺失，结果显示缺失2A1的复制子均荧光素酶报告基因均不能进行有效的表达；然而单独缺失2A2的复制子与原始复制子无显著差异。但是含有2A3缺失的复制子其复制效率将显著下降。最后我们采用EMSA和紫外交联的方法研究2A3蛋白与病毒RNA之间的相互作用，并鉴定出2A3基因的1-50bp与病毒基因组3 UTR存在显著的相互作用。还利用免疫共沉淀与真核细胞内分子杂交技术，发现了2A3蛋白与宿主细胞内翻译启始因子2E之间的存在相互作用。本研究将为深入研究DHAV的复制、表达及其调控机制等提供有价值的参考信息。