核仁素在兔出血症病毒感染、翻译和复制过程中的作用

The rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) represents the causative agent of a highly contagious disease in rabbits that is often associated with high mortality. Its genome is a positive-sense, single-stranded RNA molecule. Because of the lack of a suitable cell culture system for RHDV, progress t on the molecular biology of RHDV has been greatly restricted for a long time. So far, the pathogenic mechanism and replication of RHDV remains unclear. Nucleolin (NCL) is a multifunctional phosphoprotein which controls a wide range of fundamental cellular processes. Many researches have proved that NCL is involved in the life cycles of many pathogens, and regulate their infection and replication. Our previous study indicate that NCL could interact with several RHDV proteins (including NS7) and colocalized with NS7, suggesting that NCL may play a role in the process of RHDV infection and replication. However, its specific function and regulating mechanism are not clear. In this project, we hope to explore the role of NCL in RHDV infection, translation and replication through applying different molecular biology techniques. The results of this project will be helpful for further study the life rules of RHDV in host cells.

兔出血症病毒（RHDV）是一种对兔具有高度致病性和致死性的烈性病毒，其基因组为单股正链RNA分子。长期以来由于缺乏稳定的体外培养细胞系，RHDV的分子生物学研究受到极大制约，其致病机理、翻译和复制分子机制目前仍存在许多疑问。核仁素是一种具有多种生物学功能的宿主蛋白，它不仅参与宿主细胞的多种生命活动，而且参与许多病原微生物的感染和复制等生命过程，并发挥重要调节作用。我们的前期研究也表明核仁素可以与RHDV的复制酶发生相互作用，抑制核仁素的表达能明显降低RHDV的复制，提示核仁素可能参与RHDV的感染和复制等生命过程，但是具体作用和机制还不清楚。鉴于此，本项目拟在解决RHDV体外培养的基础上，综合利用分子生物学方法和基因工程技术，系统研究核仁素在RHDV感染、基因组翻译和复制等过程中的作用，并探讨其调节机制。本项目研究结果对于深入研究RHDV在宿主细胞中的生命规律具有重要意义。

兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）为杯状病毒科的重要成员，对多个品种兔均具有高度致病性和致死性。长期以来，由于缺乏稳定的体外培养细胞系，RHDV生命过程中的许多分子机制尚不清楚。核仁素（Nucleolin，NCL）为宿主重要的多功能蛋白，我们前期的研究发现NCL可能参与RHDV的生命过程。鉴于此，本项目综合利用分子生物学方法和基因工程技术，系统研究了NCL在RHDV感染和复制中的作用及其分子机制。主要研究结果如下：（1）利用抑制剂及siRNA干扰技术，我们发现NCL在RHDV内化过程中发挥关键作用。（2）通过试验证明NCL通过其N端结构域与RHDV衣壳蛋白（VP60）的保守区域DVN肽(472Asp-Val-Asn474）段特异性的相互作用。（3）利用人工合成的DVN肽阻断VP60与NCL之间的结合后，病毒的内化效率明显降低。动物实验结果表明，DVN多肽可以保护大部分实验兔免受RHDV感染。这些研究结果证明NCL通过网格蛋白依赖的内吞作用介导RHDV的内化过程。（4）利用RHDV复制子系统和蛋白亲和纯化技术，我们成功分离并鉴定了RHDV复制复合物（RC）的主要成分，发现NCL与病毒蛋白（RdRp、p16和p23）参与病毒RC的形成。（5）用试验证明RdRp与病毒其他非结构蛋白不存在相互作用，而是通过NCL间接结合p16和p23病毒蛋白以及其他宿主蛋白，进而形成RC。（6）成功鉴定了RdRp、p16和p23与NCL相互作用的活性区域分别位于RdRp（第448-478位肽段）、p16（35Cys-Ile-Arg-Ala38肽段）和p23（第90-145位肽段）。（7）利用人工合成的RdRp多肽和p16多肽阻断NCL与病毒非结构蛋白的结合，发现RHDV的复制水平均显著降低。这些研究结果表明，NCL在RHDV RC的形成过程中发挥关键的桥梁作用。（8）研究证明NCL在与RHDV基因组5’末端RNA互作的同时，还能够与宿主细胞中的eIF4E相互作用，提示它可能也参与RHDV 翻译调节过程。. 综上所述，本项目研究成果不仅增加了我们对RHDV的感染、复制和翻译的分子机制的进一步理解，而且丰富了杯状病毒的分子生物学理论，为该杯状病毒感染的防控提供了理论依据。