鸭肝炎病毒VP1基因在病毒致病和免疫中的作用研究

鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis, DVH）是雏鸭的一种急性、高度致死性、接触性病毒传染病。鸭肝炎病毒（DHV）是DVH的致病病原。本病的病死率可高达60%-100%，给养鸭业造成了巨大的损失。弱毒疫苗的应用在一定程度上缓解了DHV疫情，但是在不断的免疫选择压力下，新型DHV的出现给本病的防治带来了障碍。研究发现，DHV VP1基因在病毒基因组中变异程度最大，可能与病毒的致病力密切相关。而且同属小RNA病毒科成员的FMDV VP1蛋白可诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答。鉴于此，本课题拟利用反向遗传技术，结合传统病毒学研究方法，以VP1基因为主要靶基因，深入研究该蛋白在DHV致病和免疫过程中发挥的作用和机理，为进一步明确DHV强毒致病力减弱的机理提供坚实的科学依据。

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHAV)引起的一种以肝脏肿大、出血为特征的急性、高度接触性和致死性雏鸭传染病。VP1基因作为鸭肝炎病毒最为重要的衣壳蛋白基因在病毒致病和免疫中的作用一致缺乏详尽的阐释。因此，本课题拟利用反向遗传技术，结合传统病毒学研究方法，以VP1基因为主要靶基因，深入研究该蛋白在DHAV致病和免疫过程中发挥的作用和机理。本课题研究结果主要体现在以下几个方面：⑴ 建立了对DHAV敏感的永生化鸭胚成纤维细胞系（DEF-TA）。⑵ 通过鸡胚传代致弱和强弱毒株全基因组测序分析，推测出VP1基因、VP0基因、3D基因和5’/3’UTR可能与DHAV的致病力减弱有关。(3) 成功构建了DHAV的微基因和复制子系统，并研究了5’/3’UTR对病毒翻译的影响。结果显示，5’UTR与病毒的蛋白翻译功能密切相关，而3’UTR非病毒蛋白的翻译必需的元件。⑷ 改造了原有的DHAV感染性克隆质粒的基础上，获得了pcDNA-DHAV质粒，在此基础上依次构建VP1基因的替换/缺失突变体，相关的鉴定工作真在开展中。⑸ 根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化VP1基因和截短表达VP1的方式，提高了目标抗原的表达量，并制备了相应的兔抗VP1多抗，建立了相应的间接ELISA方法。⑹ 以VP1基因为靶基因分别构建了重组杆状病毒和自杀性疫苗。体外转染和体内动物实验表明，VP1基因可在外源培养细胞中良好的表达，免疫雏鸭后后可诱导DHAV-1特异性抗体、中和抗体以及淋巴细胞增殖，而且能够完全保护雏鸭免受野毒DHAV-1的攻击，与弱毒DHAV ZJ-A株具有相似的保护效果。