白藜芦醇抑制白介素（IL）-1β诱导的关节软骨细胞凋亡机制的可视化研究

骨关节炎(OA)是麻醉科疼痛门诊常见的疾病之一，软骨细胞凋亡是其主要发病机理。致炎细胞因子白细胞介素-1β是通过诱导软骨细胞凋亡导致AO的重要因子，白黎芦醇具有极强的抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡的能力，但是其分子调控机理并不确切。以兔关节软骨细胞为对象，本项目结合现代分子生物技术，重点采用基因质粒标记、显微荧光成像和荧光共振能量转移（FRET）等技术在活细胞中实时可视化研究白黎芦醇诱导软骨细胞增殖以及抑制软骨细胞凋亡的分子调控机理。通过基因荧光质粒分别标记Bcl-2、Bax和caspases等细胞凋亡因子以及JNK、Akt等细胞增殖因子，然后利用显微荧光成像术在单个活细胞中实时监测靶蛋白的空间动态分布以及相互之间的动态相互作用，从分子水平揭示白黎芦醇促进软骨细胞增值和抑制IL-1β诱导软骨细胞凋亡的早期分子事件及其信号调控通路，探索OA疾病的分子机理和防治骨关节炎的新方法。

按照项目计划研究内容和方案，本项目结合现代分子生物技术，重点采用基因质粒标记、显微荧光成像和荧光共振能量转移（FRET）等技术在活软骨细胞中实时可视化研究了白黎芦醇抑制软骨细胞凋亡的分子调控机理。在本项目的资助下，发表学术论文17篇，其中SCI收录论文11篇。主要成果包括：.1、在活细胞中发现了过氧化氢（H2O2）通过AIF介导的caspase非依赖性线粒体途径和死亡受体介导的外源性途径诱导兔关节软骨细胞凋亡：发现caspase-3 和 caspase-8而不是caspase-9参与H2O2诱导的软骨细胞凋亡，H2O2诱导软骨细胞线粒体膜电位的下降，H2O2诱导AIF而非Cyt.c从线粒体释放，Bid及Bax没有参与H2O2诱导的线粒体凋亡途径；.2、首次证明了白藜芦醇（RV）通过清除硝普钠（SNP）诱导产生的NO非依赖的ROS来抑制SNP诱导的细胞凋亡的新机理：发现了SNP诱导了兔关节软骨细胞的介由caspase依赖的内源性通路的凋亡。发现了RV抑制SNP诱导的兔关节软骨细胞凋亡。发现了SNP诱导软骨细胞内ROS的快速生成，并于一定时间内内达到饱和，但是NO产生缓慢且在SNP处理一段时间后开始上升。发现了RV几乎完全抑制了SNP诱导的ROS，而不是NO而NO清除剂—HG或PTIO，抑制了SNP诱导的NO，但是没有抑制ROS。发现了NAC预处理显著抑制了SNP诱导的ROS和NO，RV和/或NAC的预处理明显抑制了SNP诱导的细胞凋亡，但是PTIO预处理对于SNP诱导的细胞凋亡没有表现任何的抑制作用，线粒体膜电位的流式细胞仪分析结果显示RV或NAC抑制了SNP诱导的线粒体膜电位下降。RV抑制SNP诱导的细胞骨架重塑； .3、采用原子力显微术（AFM）进行了白藜芦醇通过改变细胞骨架和纳米机械力学性质保护软骨细胞免于凋亡的研究：探测了软骨细胞形貌，膜结构，骨架，纳米机械性质（硬度和粘附性）的变化，发现AFM可以在纳米和pN水平上揭示RV抑制SNP诱导的软骨细胞形貌和机械性质的变化。RV能够通过改变细胞的形貌，机械力学性质来保护细胞的生长和迁移，RV改变细胞的刚性主要通过下调细胞骨架蛋白F-actin而不是α-tubulin 来实现的， AFM可以作为细胞水平上表征骨关节炎演变的一种潜在的纳米工具。