具有脱糖基和脱甲基活性功能基因菌的研究

在国家自然科学基金（No.30672622）的资助下课题组从人体肠道菌中获得一新型菌株S1，其具有脱糖基和脱甲基的活性，可转化底物亚麻籽粕中开环异落叶松树脂酚二糖苷而产生开环异落叶松树脂素 (SECO) 和4，4′-二羟基肠二醇 (DHEND)。 SECO和DHEND均为国际公认的两种哺乳动物雌激素肠二醇和肠内酯的总前体。本项目将以S1菌株为研究对象，①采用最新测序技术SOLiD系统对S1进行全基因组测序，利用基因工程手段和DNA重组技术，克隆出功能基因的全序列，在大肠杆菌中进行表达以定向构建高产菌株。②建立利用DNA重组工程菌对苷类天然产物和含甲氧基天然产物进行结构修饰的生物合成体系。研究意义：本研究不仅提供活性物质SECO和DHEND的一种新的生物合成方法，所获取的具有脱糖基和脱甲基功能的DNA重组工程菌可以为天然产物的结构修饰提供生物合成新方法。

本研究在前期工作中从人体肠道菌中分离得到了两株细菌Bacteroides uniformis ZL-I和Eubacterium limosum ZL-II. B. uniformis ZL-I可以转化异落叶松树脂酚二葡萄糖苷（Secoisolariciresinol Diglucosidase, SDG）生成其糖苷异落叶松树脂酚（Secoisolariciresinol, SECO）; E. limosum ZL-II可以继续转化SECO生成脱甲基产物4，4′-二羟基肠二醇 (DHEND), DHEND 为植物雌激素成分类肠二醇（Enterodiol, END）和肠内酯（Enterolactone, ENL）的前体物质。.SECO在防治更年期妇女综合征方面已被证明具有潜在的药用价值，END和ENL具有雌激素和抗雌激素双向调节作用，对于防治乳腺癌、结肠癌、心血管疾病、骨质疏松等疾病，具有良好的药用价值。. 为解决细菌发酵存在的培养体系大、去除菌体的工艺处理繁琐、细菌发酵效率低、转化时间较长、多次传代易使细菌转化活性降低甚至消失等问题，本课题组确定了鉴定、克隆并在大肠杆菌中异源表达B. uniformis ZL1中的葡萄糖苷酶基因以及E. limosum ZL-II中的甲基转移酶的研究思路。同野生细菌经多次传代可能丢失活性甚至变异不同，通过基因重组技术得到的葡萄糖苷酶可以重复且稳定的进行所需要的转化反应。此外，酶催化反应还具有设备简单、底物耐受度大、培养体系较小且反应效率高的优点。. 本课题对菌株B. uniformis ZL-I 中β-D-葡萄糖苷酶的功能基因进行了克隆、表达、性质及转化工艺研究。首次鉴定和克隆了B. uniformis中的β-D-葡萄糖苷酶，完成了B. uniformis中的β-D-葡萄糖苷酶的异源表达，并考察了B. uniformis中的β-D-葡萄糖苷酶的性质，使用重组的β-D-葡萄糖苷酶进行SDG到SECO的转化，确定了粗酶水解SDG的最佳工艺条件。本研究还对菌株E. limosum ZL-II中甲基转移酶的功能基因进行了探索性研究，筛选与表达了O-脱甲基酶基因的蛋白。