海绵内生放线菌中以ent-CPP为前体的二萜类天然产物的发现及生物合成路径中二萜合成酶的特征研究

Diterpenoids (DTs) comprise the largest family of natural products and play important roles in all living organisms. DTs of plant and fungi origins have been extensively discovered, however, DTs of bacterial origin are known but rare. Recent advances in genomics have revealed that the biosynthetic potential for terpenoids in bacteria, particularly in actinomycetes, may be significantly underestimated. In our previous discovery of DTs from actinomycetes, 25 potential DTs producing strains were screened from 100 soil actinomycetes using a two-tiered PCR method. In this project, we continue to screen potential DTs producing strains from sponge endogenous actinomycetes, using DT synthases as the searching targets. On the basis of the PCR-based screening, chemical investigation and the whole genome sequence, we carry out the following research: 1.discovery of DTs from sponge endogenous actinomycetes based on the PCR screening; 2.sequencingand identification of the DT biosynthetic gene clusters and characterization of the genes’ functions by gene deletion; 3.heterologous expression of DT synthases in E.coli, and characterization of the enzyme activity in vitro. Significances: 1. developing new idea and methods for microbial natural products research; 2.Enriching thestructural diversity of DTs from bacteria; 3. Characterizing the biosynthetic pathway of DTs in sponge endogenous actinomycetes and laying the foundation for more DTs discovery.

二萜广布于植物和真菌中，具有多种生物活性。细菌来源的二萜类成分研究较少报道。基因组学研究结果预测很多细菌，特别是放线菌，含有二萜合成酶，应成为二萜的重要生物来源。前期工作中，以ent-copalyl diphosphate (ent-CPP) 合成酶的保守序列为引物，利用PCR技术从100株土壤放线菌中筛选到25株阳性菌。本项目拟从海绵内生放线菌中筛选二萜生产阳性菌株。结合化学研究和全基因组序列分析，开展以下研究工作：从PCR阳性菌株中发现二萜类成分；分析新型二萜类成分的生物合成基因簇，利用基因敲除等分子生物学手段揭示目标化合物的生物合成路径；异源 (E.coli) 表达合成路径中二萜合成酶，对其酶学特征进行研究。本项目研究结果为二萜类成分的发现提供可借鉴的研究思路和方法；丰富自然界中微生物来源二萜类成分的结构类型和数量；为二萜合成酶基因工程菌株的构建及新型二萜类化合物的制造奠定工作基础。

本项目基于细菌来源的二萜类成分发现困难、二萜合酶生物学功能研究较少的研究背景，开展了利用基因组挖掘技术从海洋来源放线菌中筛选二萜生物合成基因簇，并进行基因簇的激活与表达、以及二萜合酶的生物学功能等研究工作。主要研究成果包括：采集来自我国泸州岛、南海永兴岛和涠洲斜阳岛海域的海绵及珊瑚等生物样品，分离得到海洋来源内生放线菌2542株，建立了北京大学海洋生物样品内生放线菌菌种库和基因组DNA库；利用基因组挖掘技术（PCR筛选）从海洋内生放线菌菌库中筛选10株含有二萜合酶编码基因的阳性菌株，并分析确定了3条二萜化合物生物合成基因簇和5个二萜合酶编码基因（1645/1646/04542/04548/07020）；对新发现二萜合酶的生物学功能进行了系统研究，基于二萜生物合成途径及新发现二萜合酶编码基因构建了生产二萜骨架化合物的大肠杆菌基因工程菌株，已获得二萜骨架化合物6个；解析了二萜合酶1646的蛋白结构。萜类活性化合物的合成生物学研究为国际研究热点，本项目在国内引领性构建了海洋来源二萜类成分发现及二萜合酶催化机制研究的平台，为将来深入开展活性萜类分子合成生物学研究及萜类合酶基因工程改造等工作奠定了重要的工作基础，研究成果具有重要的学术价值；活性萜类分子具有多种生物学活性，为重要的药物先导物，因此本项目的研究成果在医药领域具有重要的应用价值。