单子叶植物蓝色花形成关键转录因子基因克隆与功能研究

针对自然界中存在许多单子叶蓝色花形成的问题，选择单子叶野生型蓝色花植物为研究对象，采用花色表型观察和相关生理生化检测，确定其蓝色形成的主要途径；根据其各自的蓝色形成途径和关键物质基础，筛选具有共性和典型性的一种代表植物，克隆调节蓝色着色模式的特异转录因子基因；利用酵母单杂交和基因枪法分析转录因子的转录激活活性；使用农杆菌介导法将转录因子基因转入夏堇中过量表达，分析不同转基因株系中花色表型、相关生理指标的变化，通过Real-time PCR分析结构基因的表达变化。利用RNA干扰技术和基因枪转化法在所选蓝色花花瓣中进行抑制表达分析，进一步确定转录因子基因在蓝色花形成中的功能。为利用基因工程进行蓝色花定向改良提供候选基因资源和功能依据。

针对自然界中存在许多单子叶蓝色花形成的问题，以16种具有不同蓝色色调的单子叶野生型蓝色花植物为研究对象，通过花色表型、物质代谢、基因表达及功能综合研究单子叶植物蓝色花的成色机理和花色调控模式。首先，通过花瓣解剖结构观察，花青素和辅色素成分、含量分析，花瓣pH值和金属元素测定，系统研究了其蓝色形成的物质基础和理化因素。研究结果表明：除鸢尾科植物以外，飞燕草类花青素在单子叶蓝色花花色形成中发挥了关键作用，而矢车菊素赋予花瓣不同程度的紫红色调；杨梅素和二氢杨梅素等可能作为辅色素参与了蓝色形成过程；其次，根据其各自蓝色花发育的途径和关键物质基础，筛选了一种具有共性和典型性的代表植物葡萄风信子。建立了蓝色葡萄风信子及其白色突变体转录组数据库，获得了90, 477条unigenes，功能注释表明其中143条序列可能涉及葡萄风信子花色形成过程；结合代谢谱信息分析与代谢物质变化研究，绘制了葡萄风信子花色代谢模式图；系统评估了葡萄风信子花色代谢总通量的流动模式和不同支路的生产力，进一步确定了飞燕草素在葡萄风信子蓝色形成过程中的核心地位；结合类黄酮物质测定和生物信息学分析，提出了葡萄风信子无法合成蓝色飞燕草素是由于二氢黄酮醇4 -还原酶(DFR)的低表达和黄酮醇合成酶(FLS)的强烈竞争的假说；最后，从转录组数据库中筛选并克隆了葡萄风信子花色形成关键基因DFR、FLS与调节蓝色着色模式的特异转录因子MaMybA1、MaMybA2、MabHLH1和MaWDR，双荧光法体外验证表明转录因子MaMybA1可单独激活MaCHI、MaDFR、MaANS启动子，而MaMybA2需与AtTT8形成转录复合物，才能大幅上调MaCHI、MaDFR、MaANS的表达；将MaMybA1在烟草中过量表达，转基因烟草叶片积累花青素并呈现红色表型，进一步确定了MaMybA1基因在葡萄风信子花青素代谢途径中的调控功能。本研究初步揭示了葡萄风信子蓝色花形成途经及生理机制，为利用基因工程进行蓝色花色品质改良，特别是为单子叶蓝色花育种提供蓝色花色基因及功能依据。