CRISPR-Cas调控大肠杆菌SOS反应影响志贺毒素表达的分子机制

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains are important zoonosis pathogens, which generate toxins that cause severe human diseases, such as haemorrhagic colitis and haemolytic–uraemic syndrome (HUS), resulting in deaths of humans and animals. However, many questions remain unclear regarding the exact regulatory mechanism of toxin production. Our preliminary data showed that the E. coli CRISPR-Cas system represses toxin expression and phage release by targeting the Stx2 phage in the bacteria genome. To elucidate the molecular network and regulation mechanism, based on the gene deletion and transcriptome techniques, as well as proteome analysis, the regulating effect of CRISPR-Cas system on SOS response regulator RecA, LexA and Stx2-converting phage regulator, polynucleotide phosphorylase (PNPase), and poly(A) polymerase (PAP I) will be mainly explored in this proposal. Furthermore, the molecular signaling pathway of activated CRISPR-Cas system affecting the SOS response will also be addressed. Taken together, this study will elucidate the molecular mechanism of how the CRISPR-Cas system of STEC strains targeting phage release and toxin expression, which are virulence markers of STEC isolates. This investigation will be conducive to inhibit the phage release, toxin production, and horizontal gene transfer, in order to provide theoretical foundation for effective control of STEC.

产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是重要的人兽共患病原菌，其产生的毒素能引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征，导致人和动物死亡，但其毒素产生的具体调控机制尚不完全清楚。项目组前期研究发现，大肠杆菌CRISPR-Cas系统的激活可靶向基因组中Stx2噬菌体，抑制Stx毒素表达及噬菌体释放。为阐明其分子调控机制，本项目将基于基因缺失、转录组、蛋白组等技术，重点聚焦大肠杆菌CRISPR-Cas对SOS反应关键调控因子RecA和LexA，以及对Stx噬菌体溶原转换调节因子多核苷酸磷酸化酶（PNPase）和poly(A)聚合酶（PAP I）的调控作用和网络；通过噬菌体溶原揭示CRISPR-Cas影响SOS反应从而调控Stx毒素表达的分子路径，最终阐明CRISPR-Cas调控STEC噬菌体释放及毒素表达的分子机制，为抑制Stx噬菌体溶原菌的噬菌体释放、毒素表达及基因水平转移，有效防控STEC提供理论依据。

Stx噬菌体介导的毒力基因水平转移是导致非致病大肠杆菌转变成高致病产志贺毒素大肠杆菌的主要原因，如何抑制噬菌体溶原和毒力基因转移是有效防控STEC的关键。理化因素或抗生素诱导的细菌SOS反应导致STEC菌株表达Stx毒素，因而应用抗生素治疗致病性STEC感染可能会上调其噬菌体释放和毒素产生的水平，加剧STEC的危害，而其毒素产生的具体调控机制尚不完全清楚。本项目在前期研究基础上，通过基因缺失及转录水平检测等技术，研究了大肠杆菌CRISPR-Cas系统对细菌SOS反应关键调控因子recA、lexA和Stx噬菌体溶原裂解相关基因及溶原转换调节因子的调控作用和分子机制。研究发现CRISPR-Cas系统激活后，能上调关键抑制性基因lexA的转录并抑制SOS激活基因recA的水平，表明CRISPR-Cas能抑制细菌SOS反应。进一步研究发现，噬菌体的间隔序列匹配能有效增强CRISPR-Cas对SOS应答的调控作用。针对SOS关键基因缺失株的研究也证实，recA缺失导致细菌在丝裂霉素C诱导下的噬菌体释放及毒素产生受到明显抑制，同时也影响溶原裂解相关基因的转录水平。深入研究发现Cas蛋白参与细菌的DNA损伤修复，从而抑制DNA损伤介导的SOS应答，影响细菌毒力等相关生物学特性。此外，研究还发现，RNA多聚腺苷化酶PNPase和poly(A)聚合酶PAP I的转录水平与SOS应答的激活呈正相关，且在CRISPR-Cas激活后，作为应激反应主要调控因子的rpoS在应激状态下的转录水平受到明显抑制。本项目通过相关研究阐明了CRISPR-Cas系统通过调控细菌SOS反应、rpoS以及recA和lexA等关键基因、抑制RNA多聚腺苷化酶活性，实现对STEC菌株噬菌体裂解释放和毒素产生等毒力指征的调控作用，为临床有效防控STEC、规避抗生素诱导的细菌毒力增强，提供了基础数据和理论参考。