密度感应信号分子AI-2激活大肠杆菌CRISPR-Cas适应性免疫的分子基础与调控机制

CRISPR-Cas are prokaryotic adaptive immune systems that provide protection against bacteriophage and other invaders, however little is known about how CRISPR-Cas systems are activated and regulated under physiological condition in E. coli. Our preliminary data has shown that the CRISPR-Cas immune systems could be activated through type II quorum sensing pathway by signal molecule AI-2 at high cell density. To elucidate the molecular network and regulation mechanism of CRISPR-Cas immune system activation including adaption, expression, and interference processes, which is mediated by QS AI-2, this proposal will focus on the effect of different cell density and the luxS gene encoding AI-2. In this proposal, transcriptome, proteome analysis as well as co-immunoprecipitation assay will be employed to identify the functional genes that are involved in AI-2 mediated CRISPR-Cas activation pathway, and the functional proteins that play vital roles in the activation process of CRISPR-Cas. Furthermore, this proposal will confirm the hypothesis that the QS molecule AI-2 could modulate both type I and type II QS system by SdiA and affect effector protein H-NS to regulate the activation of CRISPR-Cas. Taken together, the regulatory networks and the molecular mechanism of CRISPR-Cas activation mediated by QS AI-2 will be elucidated. The goal of these investigations is to regulate E. coli adaptive immunity by screening and applying immune activation inhibitors, which improves the infection efficiency of therapeutic phage and controls antibiotic resistant E. coli.

细菌CRISPR-Cas适应性免疫可抵御噬菌体等外源基因入侵，但对其在生理状态下如何被激活却知之甚少。项目组研究发现Ⅱ型密度感应(QS)信号分子AI-2可激活大肠杆菌CRISPR-Cas，为了阐明其分子调控机制，本项目将基于基因缺失、转录组、蛋白质组和免疫共沉淀等技术，系统研究大肠杆菌AI-2对CRISPR-Cas适应、表达和干扰等功能的调节作用；发掘介导AI-2激活CRISPR-Cas的功能基因，揭示发挥枢纽作用的功能蛋白及其作用机制；证实AI-2可通过SdiA介导，利用Ⅰ型和Ⅱ型两类QS系统的相关分子，进而影响H-NS等相关效应蛋白，实现对大肠杆菌CRISPR-Cas调控的科学假说，最终系统阐明大肠杆菌AI-2激活CRISPR-Cas的调控网络和分子机制。为筛选、应用细菌免疫抑制剂，降低大肠杆菌的适应性免疫能力，提高治疗性噬菌体的感染效率，防控耐药性大肠杆菌感染提供理论和应用依据。

大肠杆菌在演化过程中形成了多种抵御噬菌体等外源基因入侵的免疫机制，其中CRISPR/Cas是一种高效的适应性免疫系统。项目组前期发现Ⅱ型密度感应信号分子AI-2可激活大肠杆菌CRISPR-Cas，为探究大肠杆菌中CRISPR/Cas系统是否受QS系统的直接调控，我们针对QS系统中信号分子AI-2合成基因luxS以及调控基因lsrR对CRISPR/Cas系统的调控功能进行分析。研究发现QS系统lsrR的缺失导致CRISPR/Cas系统中cse1操纵子的表达水平降低。而且在不添加葡萄糖的培养条件下，lsrR的缺失导致cse1操纵子抑制基因hns表达水平的提高。表明QS系统中lsrR可通过调控hns的表达来影响CRISPR/Cas系统cse1的表达。进一步筛选调控大肠杆菌CRISPR/Cas系统Cas3操纵子的功能分子，采用转座子随机突变技术，发现大肠杆菌gcvP基因能够直接或间接调控Cas3的表达。由gcvTHP操纵子编码的甘氨酸裂解系统（Glycine cleavage system，GCS）通过催化甘氨酸产生的N5, N10-亚甲基四氢叶酸促进Cas3的表达。同时，cAMP受体蛋白（CRP）通过形成cAMP-CRP复合物并结合于Cas3启动子区促进Cas3表达；当CRISPR/Cas系统激活时，GCS或CRP功能的缺失导致CRISPR/Cas系统的干扰功能显著减弱，并增加了大肠杆菌对噬菌体的敏感性。结果表明，GCS和CRP通过协同调控Cas3表达来影响细菌对噬菌体的敏感性。为进一步探究介导大肠杆菌抵御噬菌体感染的新型QS信号分子，本研究通过改变培养时间、酶解实验及质谱分析，发现大肠杆菌高密度（OD600＞1.0）培养上清中的小分子化合物可以介导细菌抵抗噬菌体感染。通过吸附试验、感染增殖试验以及荧光定量PCR实验确定了高密度上清液中的活性物质能够影响噬菌体的感染，借助HPLC-MS技术发现该小分子物质的分子量约为192 Da。.综上，本研究成功获得具有潜在调控大肠杆菌CRISPR/Cas系统的功能蛋白，详细阐述了GCS和CRP通过调控大肠杆菌 CRISPR/Cas 系统进而抵御噬菌体感染的分子机制。研究结果挖掘了新的功能分子，阐明了CRISPR-Cas抵御噬菌体发挥枢纽作用的调控机制，为噬菌体突破CRISPR/Cas防御屏障，提高治疗性噬菌体感染效率提供了理论基础。