CRF-CRFR1对小鼠脑血管通透性的影响及其机制研究

Our previous results show that CRF can increase vascular permeability via activation of cPLA2. We recently found that experimental brain ischemia caused activation of Src-cPLA2, which is consistent with the report that in HRMVECs hypoxia induced activation of Src-PLD1-PKCϒ-cPLA2 pathway. Moreover, we found that CRFR1 plays a role of decreasing vascular permeability in transient MCAO (tMCAO). However, on the contrary, in permanent MCAO (pMCAO), CRFR1 activation offset the vasoprotective effect of S1PR2 antagonist, JTE013. These results suggest that the working mechanisms of CRFR1 in the two models are complex and different, which may be attributed to the different ischemic time & reperfusion injury and may be highly associated with S1PR2. The present project will further focus on the effect of CRFR1 and action mechanism in tMCAO and pMCAO, combining the method of CRFR1-interfering virus carrier injection. Furthermore, two brain vascular endothelial cells, bEnd3 and hBMVEC will be used for exploration of CRFR1 action and the participation of Src-PLD1-PKCϒ-cPLA2 pathway. This study will provide a new insight into the stroke mechanism and its therapeutic target.

本实验室发现CRF可激活cPLA2而增加血管通透性。我们最新预实验显示小鼠脑缺血可激活Src-cPLA2通路，与报道的视网膜微血管内皮细胞低氧可致Src-PLD1-PKCϒ-cPLA2激活一致；CRF通过CRFR1在暂时性大脑中动脉阻塞模型（tMCAO）中降低血脑屏障通透性、减小水肿率、减小梗死面积；但在永久性大脑中动脉阻塞模型（pMCAO）则抵消S1PR2拮抗剂JTE013的脑血管保护作用。提示CRFR1对脑卒中的影响复杂、与缺血时间/再灌注损伤相关、且与S1PR2有密切关联。本项目将采用tPMCAO 与pMCAO，结合慢病毒载体注射探讨CRFR1对缺血性小鼠脑卒中的影响及作用机制；采用脑血管内皮细胞bEnd3 与hBMVEC结合慢病毒载体转染探索CRFR1对内皮单层通透性的影响及Src-PLD1-PKCϒ-cPLA2信号通路的参与。研究将为探索脑卒中发病机制及药物防治靶点提供新的视角。

该项目在前期发现CRFR1（CRHR1）影响血管炎症发生发展的基础上提出主要科学假说：CRF/CRFR1对脑血管通透性有明显的影响从而在缺血性脑卒中中发挥重要作用； 其主要作用机制可能与其对S1PR2、cPLA2的影响密切相关。项目实施以来，针对以上假说，我们进行了三个大方面的研究并取得了较明确的研究成果。采用了小鼠脑缺血（MCAO）模型，探索了CRFR1对缺血性脑卒中时脑血管通透性的影响及其与S1PR2的关系；细胞水平的研究方面，采用bEnd3 脑血管内皮细胞株进一步研究了CRFR1影响内皮单层通透性的作用及与S1PR2的关系。并在此基础上进行了扩展，采用体外氧化应激模型比较了S1PR2与S1PR3与CRHR1对脑血管内皮通透性作用的关联。在体小鼠MCAO脑缺血模型实验，证明了CRF（CRH）通过CRFR1型受体对脑血管通透性有明显的影响从而在缺血性脑卒中中发挥重要作用。CRF-CRFR1影响脑血管内皮通透性、参与小鼠缺血性脑损伤，S1PR2参与介导了这一作用；而采用过氧化氢刺激的小鼠脑微血管内皮细胞 bEnd3 细胞实验也证实了S1PR2与脑血管内皮通透性相关。进一步的机制研究发现CRFR1通过cPLA2影响了脑血管通透性；细胞水平研究发现了CRFR1对bEnd3脑血管内皮细胞单层通透性的影响，作用机制也与cPLA2相关。另外，我们发现，S1PR2与S1PR3对应激状态下脑血管内皮通透性作用相反，证实了S1PR3对内皮通透性起到稳定作用，阻断/敲低这一受体显著增加内皮单层通透性,而这一作用与S1PR2相反；有趣的是，CRH-CRHR1对S1PR2与S1PR3的作用均起到逆转作用。这些研究成果为缺血性脑卒中的机制探索提供了新的视点，对研发防治缺血性脑卒中的新药、探索新药作用靶点具有重要意义。项目研究成果共发表相关SCI论文5篇（第一标注），培养博士生4名，硕士生4名。