真菌耐受的发生机制及小分子拮抗剂的发现

Fungal persistent (persister formation) is a self-regulating mechanism and differs from fungal resistance. The formation of the persister resulted the failure for clinically treating fungal infections. Hence, illustration of the fungal persister inducing mechanism and discovery of small molecular antagonist are particular importance for the treatment of fungal pathogens. In our previous work, rapid identification and screening protocols for fungal persisters have been established, and bisbibenzyls and triterpenoids isolated from bryophyta have been found to be active inhibitors of fungal biofilm and persisters. Based on above results, the aim of the present study is listed as follows. i) To achieve the high-though isolation of fungal persisters by optimizing the screening method and high-producing culture condition; ii) to clarify the relationship between fungal persistent and gene expression, and find out the persister inducing mechanism by analyzing their genome; iii) To establish the bioactive screening method for persister inhibitors in vitro, and carry out the purification, biological evaluation, chemical synthesis and modification of small molecules from bryophyta and their endophyte to discover the inhibitors of fungal persisters; iv) To illustrate the molecular mechanism of fungal persistent inhibitors, and evaluate antifungal effects of the bioactive molecules used alone or combined with clinically used antifungal drugs in vivo. The results of our study will build a novel mentality for drug discovery, and lay the groundwork for the treatment of clinical fungal infection.

真菌耐受（即持留菌的产生）是不同于耐药的一种自体调节机制，是导致临床真菌感染治疗失败的重要原因。阐明真菌耐受的形成机制，发现具有抑制真菌耐受作用的小分子化合物对于治疗临床真菌感染具有重要意义。前期研究建立了真菌持留菌的快速识别与筛选方法，发现从苔藓中分离获得的联苄、三萜类化合物能够抑制被膜形成，减少持留菌的产生。在此基础上，本课题通过优化真菌持留菌的筛选方法，筛选持留菌高产的培养条件，实现对持留菌的高效分离；开展持留菌基因组分析，阐明真菌耐受与基因表达的相关性，揭示真菌耐受的发生机制；建立真菌耐受抑制剂体外筛选模型，开展苔藓及其内生菌中具有抗真菌耐受作用的小分子化合物分离、结构修饰和活性评价，寻找活性化合物；阐明活性化合物抑制真菌耐受的分子机制，并测定活性化合物单体或与临床药物联合用药的体内克服真菌耐受的作用，建立抗真菌药物发现的新模式，为克服临床真菌耐受奠定研究基础。

该研究建立了白色念珠菌持留菌的快速识别和检测方法，优化了持留菌高产培养条件，为持留菌的发生机制研究奠定了基础，同时建立了有效的抑制持留菌筛选模型；通过基因敲除等方法发现氧化应激相关基因参与了白色念珠菌持留菌的产生；首次揭示了真菌中广泛存在的脂泡具有自我保护作用，脂泡可以将脂溶性药物包裹在其中，抑制活性氧的产生发生耐药；首次发现真菌被膜中的Als1和Als3蛋白能够调控铜离子转运体基因CRP1的表达，增强金属铜杀菌的敏感性，这对理解铜对真菌被膜的清除作用具有重要价值；对7种苔藓和8种苔藓或地衣内生真菌进行了化学成分的分离，发现了200多个化合物，对这些化合物进行抗真菌活性筛选，发现5类具有抗真菌的活性分子，从地衣内生真菌中分离得到的三联苯类化合物通过破坏细胞膜的完整性发挥抗真菌作用；庚烯酮类化合物能够效抑制外排泵的功能而逆转唑类耐药；二苯醚类化合物能够引起胞内活性氧的升高，从而造成线粒体功能损伤和细胞膜的损伤，最终杀灭真菌，此外该类化合物还具有强的逆转耐药作用，与临床药物联合使用不仅能有效清除悬浮态的白色念珠菌，而且对耐药性极强的被膜也表现出强的清除作用；吡啶类化合物能够干扰麦角甾醇的合成发挥抗真菌作用，该类化合物的抗真菌活性与临床药物氟康唑相当，而且对唑类敏感株和唑类耐药株均表现出了极强的抑菌活性，而对秀丽隐杆线虫无细胞毒作用，显示了较好的应用开发价值；对150种地衣内生真菌发酵产物粗筛发现一株真菌的发酵产物能够有效逆转临床白色念珠菌的唑类耐药，却无明显细胞毒作用，对该菌发酵产物进一步分离得到一系列醌类衍生物，这类化合物能够有效抑制外排泵的活性和多药耐药外排泵MDR1的表达实现耐药逆转；从龙葵中分离得到的甾体生物碱能够调控Ras1-cAMP-PKA信号通路有效抑制真菌毒力。本课题中建立的筛选模型以及筛选得到的活性分子对抗真菌剂的开发奠定研究基础。