小鼠肺组织定居性记忆T细胞的抗流感作用及其作用机制研究

Resident-memory T cells (TRM) play a critical role in protection from pathogen infection, however, it remains to be defined for the role of lung TRM in protective immunity against Influenza. We previously established an H9N2 (low pathogenic virus) infection model to characterize lung TRM. On top of this model, we will employ highly pathogenic H7N9 Influenza to attack previously H9N2-infected mice to test the protective effect of lung TRM (This model will minimized the inference from antibody-mediated protection), compare the survival of mice in the presence versus absence of TRM, key gene knockout versus intact to corroborate TRM-mediated protection and determine the key protective gene; Meanwhile, comparative analyses will be performed on RNA-seq data from TRM before versus after secondary responses (TRM itself and lung tissues) to decipher TRM-mediated protection mechanism; These data will be further confirmed by in site RNA hybridization and immune fluorescence staining. Overall these project aims to unfold the lung TRM working mechanism during Influenza infection, the data extracting from this project will highly enlighten other researches on lung TRM during other microbe infections and on the development of vaccine against respiratory pathogens and of immune intervention strategies.

组织定居性记忆T细胞（Resident-Memory T cells, TRM）在抗感染中发挥至关重要的作用，但肺组织TRM的抗感染作用与作用机制依然不清。本项目拟在已经建立的低致病性流感病毒H9N2感染小鼠建立TRM基础上，利用内源基因高度同源的高致病性H7N9感染小鼠，建立攻击-保护模型观察TRM的抗流感作用；同时，对比观察TRM存在与缺失、关键基因敲除与未敲除小鼠在H7N9攻击后的生存情况，以确认TRM保护作用及介导保护的关键基因；利用RNA-Seq获取转录组数据，对比分析TRM再次应答前与应答后自身及肺组织的免疫应答，系统解析TRM介导的免疫应答及其对肺组织免疫微环境的作用；经原位杂交与免疫荧光技术，验证RNA-Seq分析数据。本项目将较系统解析肺组织TRM抗流感的作用机制，对研究肺组织TRM抗其他病原体感染有借鉴价值，为研制保护效果更佳的抗呼吸道病原体疫苗及临床免疫干预奠定基础。

针对流感病毒内部保守抗原表位的CD8+ T细胞由于能介导更为广泛的保护作用而成为广谱流感疫苗的研究热点。越来越多的研究表明一种新型的记忆T细胞亚型：组织定居性记忆T细胞（Tissue Resident Memory T cells，TRM），在抗病毒感染中发挥重要作用。.我们对人感染新型H7N9禽流感病毒住院病人的临床样本研究发现，在体内无特异性中和抗体的情况下，H7N9特异性CD8+ 记忆T细胞的活化与临床良好的预后有关。为了进一步了解流感病毒再次感染时，体内预存的CD8+ 记忆T细胞介导免疫保护的特征，我们首先用低致病性禽流感病毒H9N2感染小鼠建立免疫记忆，再用内部蛋白高度同源的高致病性H7N9病毒攻毒小鼠，建立了免疫-攻击保护模型观察流感特异性CD8+ 记忆T细胞的抗流感病毒作用。我们从体重、生存率、病毒载量、炎症诱导和病理变化各个方面确认了H9N2免疫对H7N9感染提供近乎100%的交叉免疫保护。随后，我们通过过继血清，CD8+T细胞删除实验证实了CD8+ T细胞而不是抗体在流感交叉免疫保护中起重要作用。.为了进一步研究呼吸道抗原特异性TRM细胞介导的免疫保护特征，我们采用特异性识别小鼠淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV）CD8+ T细胞抗原表位GP33-47的T细胞受体转基因小鼠，过继其CD8+ T细胞到野生型小鼠体内，然后用LCMV病毒和表达GP33-47抗原表位的重组流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）（PR8-GP33）交叉感染的方式，构建GP33-47单表位特异性CD8+ 记忆T细胞介导交叉免疫保护的模型。通过PR8-GP33滴鼻感染，建立GP33-47表位特异性记忆T细胞，也能够单独介导对LCMV病毒感染的交叉保护，显著抑制病毒复制。呼吸道TRM细胞基本不表达CD11a。芯片分析实验表明，在再次感染后12h，这些细胞开始上调IFN-γ与Ⅰ型IFN，TRM表达IFN-γ的时相与感染后肺组织ISG的表达基本一致。随后我们通过原位染色，qPCR等手段验证了这些数据，并进一步证实了单表位TRM的保护作用。.综上所述，我们揭示了TRM的保护作用机理之一，即通过上调IFN-γ的表达，进而刺激ISG的转录，抑制病毒的复制。此外，Ⅰ型IFN也很有可能与IFN-γ发挥协