基于雌激素受体甲基化的分子调控探讨六味地黄方抗更年期AS的作用机制

The low expression of estrogen receptor(ER) is the basic pathogenesis of menopausal atherosclerosis (AS). While the methylation of ER genes is the critical factor to the down-regulation of ER expression. According to previous research, we found the expression of ER was down-regulated in menopausal AS models. Liuwei Dihuang Formula was able to prevent AS by increasing the expression of ER. As a result, we put forward the hypothesis that regulating ER methylation, improving ER expression are promising to be the crucial point of Liuwei Dihuang Formula in nourishing kidney-yin, and also the essential mechanism for the intervention of menopausal AS. Our laboratory will replicate AS models on ApoE-/- mice and linked cell models, apply molecular biology techniques like BSP, RT-PCR, Lentivirus transfection and Western blotting. We will select pathological tissues and cells in different stages to argue the hypothesis from the aspects of ER methylation and screenings of methylation sites, relevant productions of methy donators(SAM,SAH) and related enzymes, DNA methytransferases(DNMTs) activity. Meanwhile, we will study the material base by using ER fluorescence labeled cell lines. At last, we hope to illustrate the mechanism of Liuwei Dihuang Formula regulating ER methylation, preventing menopausal cardiovascular diseases in order to provide scientific evidences for applying Liuwei Dihuang Formula to prevent menopausal disorders clinically from the view of epigenetics.

雌激素受体（ER）表达低下是更年期动脉粥样硬化（AS）发病的基础，而ER基因甲基化是ER表达下调的关键。前期研究发现更年期AS模型ER表达下调，六味地黄方可以通过增加ER表达来防治更年期AS。因此我们提出“六味地黄方调节ER基因甲基化，上调ER表达可能是其滋补肾阴作用的关键，也是其干预更年期AS发生的重要机制”的假说。我们将复制ApoE-/-小鼠更年期AS和相关细胞模型，利用BSP、RT-PCR、慢病毒转染、Western bloting等分子生物学技术，选取不同阶段的病变组织及细胞，从ER甲基化及甲基化位点的筛选、甲基供体相关产物（SAM、SAH）及相关酶等、甲基转移酶（DNMTs）活性等方面，来论证上述假说；并利用ER荧光标记细胞株研究其物质基础，最终从表观遗传学的角度阐述滋补肾阴的六味地黄方调节ER基因甲基化，防治更年期心血管疾病的作用机理，为其临床用于预防更年期疾病提供科学依据。

女性绝经后E2水平降低，雌激素受体（ER）表达减少，是绝经后动脉粥样硬化（AS）发生的病理基础。我们利用ApoE-/-和LDLR-/-雌性去势小鼠，给予高脂饲料复制绝经后AS-肾精亏虚浊瘀内阻病证结合模型，观察到LW的干预能够显著降低绝经后AS小鼠的血脂、主动脉斑块，上调各组织ER的表达，证实LW滋补肾阴的作用与上调ER密切相关。DNA甲基化参与了AS的调控。SAM 作为细胞内甲基化反应的唯一甲基来源，在DNMTs作用下将甲基转移至甲基受体，自身转变成SAH，后者在SAHH作用下脱去腺苷，生成Hcy。我们通过HPLC-MS技术发现LW可以通过降低肝脏中SAH含量及整体SAM/SAH比值，同时下调主动脉中SAHH表达，从而抑制绝经后AS小鼠的整体甲基化。在绝经后AS小鼠上，我们观察到LW干预后显著抑制了DNMTs的表达。内皮细胞和平滑肌细胞在AS中发挥着不同的作用。我们通过Hcy和H2O2复制人脐静脉内皮细胞损伤模型，观察到LW通过抑制DNMT1的表达，降低ESR1（ERα的基因名）甲基化程度，上调ERα表达，从而对抗内皮细胞的凋亡。但是，在Hcy、AngII和PDGF-BB复制的血管平滑肌细胞增殖模型中， LW则通过降低DNMT3a和上调去甲基化酶TET2的表达，从而降低ESR1的甲基化程度，上调ERα表达，起到抑制平滑肌增殖的作用。通过探讨ER表达与DNMTs表达之间的相关性，我们进一步证实LW是通过上调ER表达实现其滋补肾阴作用的。ER基因甲基化是ER表达下调的关键。我们通过BSP技术和MethylTargetTM目标区域甲基化测序的方法确认了绝经后AS女性主动脉、内皮细胞损伤模型和血管平滑肌细胞增殖模型中ESR1甲基化程度增加。ESR1基因的CpG岛位点5（启动子前），位点10（外显子1）和位点21（外显子8）具有翻译成氨基酸的功能。借助于DNMT3a-sgRNA定向甲基化各个位点后，我们发现位点5的高甲基化会显著抑制ERα的表达，且LW能够通过降低ESR1特定CpG岛的甲基化从而上调ER表达。此外，我们借助于分子对接实验，找到了LW中与各靶点结合度较高的化合物，初步揭示了LW防治绝经后AS的物质基础，并选取了补肾药对熟地/泽泻中的主要有效单体成分梓醇和泽泻醇进行验证。