刺血疗法对大鼠急性痛风性关节炎抗炎机制及相关基因甲基化的研究

The project is based on the research of anti-inflammatory mechanisms of pricking blood therapy on acute gouty arthritis patient. And we think that the possible mechanism for the pricking blood therapy in the treatment of acute gouty arthritis is to influence gene expression and function with the level of DNA methylation in systemic and local benign regulation of inflammatory and anti-inflammation factor and ultimately play an anti-inflammatory effect. . The project intends to establish a rat model of acute gouty arthritis, randomized comparison with the normal group, sham operation group, model group and drug group. In this trial, we can observe the effect of local symptoms of acute gouty arthritis treated with pricking blood. And at the same time, we can observe the effect of the local tissue morphology by transmission electron microscopy, the level of protein, mRNA expression, DNA methylation of inflammatory factor （IL-1β、TNF-α）and anti-inflammatory cytokines （IL-4、IL-10）, which are both in the local tissue and peripheral blood, using the techniques and methods such as ELISA, RT-PCR, high-throughput deep sequencing. Then explore the effect of, anti-inflammatory mechanism with pricking blood therapy in acute gouty arthritis. The purpose of our project is to reveal how the pricking blood therapy can relieve the heat, pain, swelling and blood stasis, and provide a scientific basis for clinical pricking blood therapy treatment of gouty arthritis, to further enrich the theoretical connotations of pricking blood therapy.

本项目在课题组前期刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的临床及机制研究的基础上，提出其可能机制是通过在整体和局部炎性和抗炎因子相关的DNA甲基化水平良性调控，来影响基因表达和功能，最终发挥抗炎效应。拟通过急性痛风性关节炎大鼠模型，将正常组、假手术组、模型组、药物组进行随机可比对照，深入观察刺血疗法对大鼠急性痛风性关节炎局部症状的影响；并应用透射电镜、ELISA、RT-PCR、高通量深度测序等先进技术和科学方法，从刺血疗法对大鼠急性痛风性关节炎局部组织形态结构学的改变及对外周血液和局部组织的炎性因子（IL-1β、TNF-α）和抗炎因子（IL-4、IL-10）的蛋白水平，mRNA表达水平、DNA甲基化水平的影响等角度，探讨刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的抗炎效应，并揭示刺血疗法的清热、止痛、消肿、祛瘀作用的现代分子生物学机制。为临床刺血疗法治疗痛风性关节炎提供科学依据，丰富刺血疗法的理论内涵。

背景：IL-1β、TNF-α和IL-4、IL-10的DNA甲基化水平与关节炎症的发生、发展有关。刺血疗法治疗急性痛风性关节炎具有清热、止痛、消肿、祛瘀的直接治疗作用。.方法及结果：改良造模方法，通过右踝关节腔注射尿酸钠结合灌服次黄嘌呤、皮下注射尿酸酶抑制剂建立急性痛风性关节炎大鼠模型。刺血组于造模完成后6h、24h在右侧昆仑穴点刺放血。造模踝关节周径的测量（造模前、造模后6h、24h、48h）及计算肿胀指数表明：造模后各时间点模型组的造模关节周径及肿胀指数均较造模前明显升高。造模后6h、24h，刺血组造模关节周径及肿胀指数均明显低于模型组及药物组。形态学观察表明刺血治疗能减轻关节腔尿酸钠的沉积，减少炎性细胞浸润，改善关节软骨细胞、滑膜的超微结构。Elisa检测表明：刺血治疗能明显减少关节局部软组织IL-1β、TNF-α的含量；明显增加IL-10含量。rt-PCR和Western Blot检测表明：刺血治疗能明显降低关节软组织IL-1β、TNF-α蛋白及基因的相对表达，明显增加IL-10的基因及蛋白的相对表达；焦磷酸测序法检测表明刺血治疗能明显降低IL-10启动子 CpG 岛甲基化率；IL-10基因启动子区甲基化水平与其 mRNA 表达呈显著负相关(r=−0.899，P=0.000)。.结论：刺血治疗能快速有效缓解急性痛风性关节炎局部症状，改善模型关节的病理形态及关节软骨细胞、滑膜的超微结构。刺血疗法治疗急性痛风性关节炎的清热、止痛、消肿、祛瘀作用，与良性调节局部软组织炎性因子IL-1β、TNF-α和抗炎因子IL-10表达有关。而刺血疗法通过DNA甲基化的表观遗传修饰调控IL-10基因表达可能是刺血疗法发挥抗炎效应的重要机制之一。.科学意义：本研究在基因修饰的层面探索了刺血治疗急性痛风性关节炎的抗炎效应分子机制，为刺血疗法在临床的进一步推广应用提供了科学依据；丰富了刺血疗法的理论内涵。