基于晶体学结构的高α-环状糊精转化率葡萄糖基转移酶区域改造

α-环状糊精是一种以淀粉为原料，由特异的α-环状糊精葡糖基转移酶催化形成的6个糖残基组成的高水溶性环状低聚糖。该产品在改善食品性能和风味中有广泛的潜在用途。现有α-环状糊精葡糖基转移酶的缺点在于催化生成α-环状糊精的同时，往往有一定比例的β-环状糊精和/或γ-环状糊精生成，影响了目标产品的产率，造成提取工艺复杂化，提取成本提高。本项目以选育的一种较高α-环状糊精产生比例的α-环状糊精葡糖基转移酶为基础，通过酶晶体结构分析，区域半理性设计改造，获得产物专一性更好(α-环状糊精的比例不低于90%)突变体酶，为高效转化生产α-环状糊精提供理想酶制剂。项目理论意义在于通过该优良酶制剂晶体结构研究，以及区域改造，对进一步从整体上认识环状糊精葡糖基转移酶家族的催化机理、实现单一环状糊精转化的理性酶学控制有重要意义；应用上，高比例的α-环状糊精产物可使后提取工艺极大简化，将产生良好的经济和社会效益。

摘要：α-环糊精糖基转移酶（α-cyclodextrin glycosyltransferase,简称α-CGTase）催化淀粉生成环糊精，多以α-、β-、γ-CD三种混合物的形式存在。天然酶的产物专一性较差，对α-CD的产率和后提取工艺皆造成不利影响。本项目通过将Bacillus sp. 602-1的α-CGTase基因构建工程菌，实现高活性表达的基础上，利用Error-PCR、定点突变、饱和突变等技术对α-CGTase基因进行分子改造，获得Y167H， Y167HHH俩个突变体酶，进一步将α-CGTase的转化专一性提高到约7.3 和13.2；同时，对获得的突变体晶体进行了结构解析和功能分析，并利用天河－1号服务器平台模拟了寡糖链在环化过程中的动力学机理，部分阐明了寡糖链特异性环化成α-CD的轨迹和特征。特别是，我们在研究中获得的突变体酶Y195I主要产物不再是α-CD，而是β-CD和γ-CD，且γ-CD所占比例提高了5倍以上，成为产物混合物中最多的一种。这一产物专一性的迁移使得有希望将Y195I突变体酶进一步人工改造成专一性更高的γ-CGTase。.概括起来，本项目研究成果包括获得Y167H、Y167HHH、Y195I三个优良催化特性的突变体；Y167H、Y195I两个突变体酶的晶体结构；高专一性α-CD及转向γ-CD形成过程中的两个寡糖环化轨迹机理。