从α-环糊精糖基转移酶到高专一性γ-环糊精糖基转移酶的人工改造及分子依据

Cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is an extracellular enzyme that converts starch into cyclodextrins (CD). The CGTases can be classified into α-/β-/γ-CGTase based on the major type in the CDs product mixture. Lots of research has been focused on improvement of the product specificity of the α-/β-CGTases. Our previous investigation revealed that an α-CGTase can produce significantly more γ-CD when tyrosine residue at the central site was mutated to isoleucine. This application will try to find out the potential subsites in the Y195I mutant α-CGTase that help improving the γ-CD productivity in combination of three dimensional structures with the site-mutations/regional evolution technologies. For the obtained artificial γ-CGTase, a series of catalytic characters will be carried out including the enzymatic characteristics, three dimensional structures, and cyclizing process by molecular dynamics analysis. The significance of this research lies in the direct jumping of the product specificity from α-CD to γ-CD based on an α-CGTase, which helps revealing the fine molecular mechanism of the CGTases. The findings will also surely provide more clues for artificial CGTase reconstruction.

环糊精糖基转移酶(CGTase)是催化淀粉生成环状糊精的酶类。前期在改造α-CGTase过程中，发现酶活性域中心位点Y195突变成异亮氨酸时，可显著提高γ-CD比例。本申请拟在此基础上，通过发掘Y195I突变体和γ-CGTase等酶蛋白的活性域或附近区域的差异，运用理性、半理性或区域定向进化技术连续改造多个潜在关键部位，使获得的突变体酶产γ-CD比例提高到65%以上，实现将一个α-CGTase人工改造为高专一性γ-CGTase的目的。并通过对该人工γ-CGTase酶学特征、三维结构、环化过程的分子动力学进行分析，阐明引起这一转换的分子依据。该研究的意义在于改造一个高产α-CD(6元环)的α-CGTase，得到的不是β-CD(7元环)为主，而是变为γ-CD（8元环）为主的突变体酶。这有助于解释酶的活性域结构与产物专一性关系，也为人工控制α-/β-/γ-CD中的一种的高专一性合成提供新思路。

总体研究目标：一是通过对实验室已有的α-CGTase突变体局部区域连续改造、筛选等，获得转化淀粉产γ-环糊精进一步提高的人工突变体酶；二是从结构/功能关系上阐明α-CGTase转换成γ-CGTase分子依据。. 研究基础：发现α-CGTase酶活性中心位点Y195位点突变成异亮氨酸时，可显著提高γ-CD的比例，且获得突变体的晶体结构以及催化动力学参数。在此基础上，进一步发掘Y195I突变体和γ-CGTase等酶分子的活性区域结构差异，运用理性、半理性或区域定向进化技术对酶蛋白进行连续改造，取得如下几方面进展和成果：. 构建或筛选到一系列γ-CD比例明显提高的突变体酶及其工程菌，其中Y260L、Y167H/G180L/Y195I、Y167H/Y195I/T341I、Y167H/Y195I/G180Y, Y167H/G179/180L/Y195I， A248P、A248E等7 个突变体酶尤为突出，γ-CD 所占的比率分别达到约40%，44.2%，47.0%，55%， 58.1%， 71.7%，75.4%。相应的， α-CD 和 β-CD 在总产物中的比例均有不同程度下降。. 横向分析了三种代表性α-CGTase，β-CGTase和γ-CGTase和糖链复合物模型的动力学特征，发现结合口袋的两个区域Region1和Region2差别明显，γ-CGTase具有更大的空间，并预测K232位点和Y260位点是其关键位点。定点饱和突变获得Y260L突变体酶使γ-CD专一性提高了3倍，验证了分子模拟的结果。指导了对γ-CGTase A248E（219）突变体酶的筛选，γ-CD 产率提高了16.2%。.解析了Y167H突变体酶的晶体结构。阐明了该位点组氨酸富集对α-CD形成的促进作用。. 建立了CGTase-十糖复合体动力学模型，有助于更全面发掘影响产物专一性的区域和氨基酸位点。. 尝试建立了基于化学诱变的基因区域诱变技术，筛选得到两个新的位点，证明这种模型具有可行性。. 科学意义：发掘发现的影响酶蛋白产物专一性的氨基酸位点、区域为以后不同目的改造提供借鉴；建立的动力学模型、化学诱变技术方法具有通用的指导意义。诱变获得的高专一性突变体γ-CGTase A248E具有开发应用的前景。