耐有机溶剂的环糊精葡萄糖基转移酶的构建及分子机理研究

Genistin, as one of major soy isoflavones, has a wide application in food and medical fields due to its great pharmacological function in vivo. However, low water-solubility of genistin greatly limits its applications. As an important genistin derivative, glycosylated genistin significantly improves the water-solubility of genistin and expands its application range. Due to low stability of most glycosyltransferase in organic phase, the catalytic efficiency of genistin glycosylation is very low. In this study, we improve the organic tolerance of the cyclodextrin glycosyltransferase from Paenibacillus macerans by molecular modification with many technologies such as random insertion and deletion mutagensis (RID mutagenesis), sequence saturation mutagenesis (SeSaM), iterative saturation mutagenesis (ISM), protein modeling software analysis and protein chimera. The expactation is to enhance the synthesis efficiency of the glycosyled genistin and to expound the organic tolerance mechanism of this enzyme. This idea and result will provide an important guiding significance for the study of other enzyme organic tolerance.

染料木苷是一种重要的大豆异黄酮，在人和动物细胞中具有重要的药理学功效，被广泛应用在食品和医药行业。由于染料木苷在水溶液中溶解度极低，极大地限制了其应用范围。糖基化染料木苷作为染料木苷的一种重要衍生物，能够改善其的水溶性，拓展其应用范围。由于催化染料木苷糖基化的大多数酶在有机介质中稳定性差，导致催化效率降低。本课题利用Random Insertion and Deletion（RID) Mutagenesis、Sequence Saturation Mutagenesis (SeSaM)、迭代饱和突变、蛋白软件模拟分析和蛋白嵌合技术对Paenibacillus macerans来源的环糊精葡萄糖基转移酶进行蛋白质工程改造，提高其在水-有机相体系中催化糖基化染料木苷的合成效率，并阐释该酶有机溶剂耐受机制。这一研究思路和研究结果对其他酶的有机溶剂耐受机制的研究也具有重要的借鉴意义。

染料木素是一种重要的大豆异黄酮，在人和动物细胞中具有重要的药理学功效，被广泛应用在食品和医药行业。其一糖基衍生物分别是染料木苷（7-O-葡萄糖基染料木素）和槐角苷（4’-O-葡萄糖基染料木素），它们作用与染料木素相似。但由于染料木素（染料木苷/槐角苷）在水溶液中溶解度极低，极大地限制了其应用范围。糖基化染料木素能够改善其的水溶性（糖链越长水溶性越好），拓展其应用范围。由于催化染料木素糖基化的大多数酶在有机介质中稳定性差，导致催化效率降低。本课题对来源于Paenibacillus macerans的环糊精葡萄糖基转移酶基因进行系统密码子优化，使其在大肠杆菌中可溶性表达量提高了152%。采用硫酸铵盐析及镍柱纯化方法获得纯度>90%的CGTase，用于催化染料木素糖基化反应。反应产物初步鉴定为(Glc)n-genistein (n=1,2,3,4),其中Glc–genistein为槐角苷。通过蛋白软件模拟分析及序列对比，对156位点饱和突变，最终获得三种突变酶A156K,A156N,A156V。经酶学性质及动力学分析，发现突变酶糖基化效率较WT均有提高。这一研究思路和研究结果对其他酶的有机溶剂耐受机制的研究也具有重要的借鉴意义。