视黄酸受体同(异)源二聚体平衡调控hMSCs成骨及成脂分化的机制

This research aims to demonstrate that the mechanisms by which retinoic acid receptors homodimer and heterodimer (RXR/RXR and RAR/RXR) regulates the balance between osteogenesis and adipogenesis of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in vitro. We will set up three groups respectively in osteogenic and adipogenic directions: control group, RAR/RXR treated group and RXR/RXR treated group. The cellular phenotypes of each groups will be analyzed, RNA-seq and miRNA profiling will be performed. Western blot will be used to check Smads protein phosphorylation. We will perform the paired and dynamic analysis of the sequencing data.Combing with miRNA target genes forecast and network analysis, we will obtain the candidate miRNAs and their candidate target genes involved in the regulation of the balance between osteogenesis and adipogenesis of hMSCs.These candidate miRNAs and their target genes will be confirmed by RT-PCR, Western blot (for encoding mRNA) and the SuperLight Luciferase Reporter Gene assay. Finally we will explore the relationship among the Smads protein phosphorylation ,miRNAs and their target genes with bioinformatics methods This research will demonstrate the molecular mechanisms of retinoic acid receptors homodimer and heterodimer regulating the balance between osteogenesis and adipogenesis, It will provide a theoretical basis for profound understanding and effective treatment of degenerative bone diseases such as osteoporosis.

本研究以平衡调控为视角，在前期成骨和成脂单一分化方向调控机制研究的基础上，沿着视黄酸受体同（异）源二聚体平衡调控成骨和成脂分化的思路开展工作。以人类骨髓间充质干细胞(hMSCs)成骨和成脂定向诱导分化过程为对象，运用Smads蛋白磷酸化检测、miRNA-seq和RNA-seq技术，动态研究正常对照组、视黄酸受体同源及异源二聚体处理组细胞的分化过程，同时分析细胞表型特征变化。对测序数据进行配对和动态关系研究，结合生物信息预测法等进行处理，获取参与同（异）源二聚体平衡调控成骨和成脂分化过程的候选miRNAs及其相应靶基因，采用实时定量PCR和荧光素酶报告基因法对靶基因进行鉴定，最后利用生物信息学方法探讨Smads蛋白磷酸化与miRNAs及其靶基因之间的关系，从而系统阐述视黄酸受体同(异)源二聚体平衡调控成骨和成脂分化的分子机制，为深刻认识和有效治疗骨质疏松这类骨退行性疾病提供理论依据。

成人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）能定向分化为成骨细胞和脂肪细胞，这两种细胞分化比例失衡可能是骨质疏松发生发展的重要因素。视黄酸（RA）可激活视黄酸受体同异源二聚体（RAR/RXR和RXR/RXR），参与细胞成脂与成骨分化的调控。深入探讨视黄酸受体二聚体调控hBMSCs成脂成骨分化的分子机制，将有助于骨质疏松发病机制的阐明。. 本项目通过视黄酸受体同异源二聚体激动剂作用于hBMSCs成骨及成脂分化过程的研究，明确了同异源二聚体信号通路对hBMSCs成脂及成骨分化的不同效应。结合TGFβ/SMADs和Wnts信号通路的研究，以及mRNA-seq和miRNA-seq等转录组学分析，最终阐明了视黄酸调控hBMSCs成骨及成脂分化过程的分子机制，重要研究结果如下：. 1．RAR/RXR激动剂ATRA等初期促进但后期抑制hBMSCs成脂分化，其作用主要通过RAR受体亚型RARβ介导，与转录因子C/EBPβ及PPARγ的转录活性被抑制相关。RXR/RXR激动剂SR11237可促进hBMSCs成脂分化，但在SW872细胞内则表现为抑制作用，提示其作用与细胞类型有关。. 2. RAR/RXR激动剂ATRA等在抑制成脂分化过程中可上调TGFβ/SMADs信号通路及Wnt信号通路的表达，同时促进SMAD2和SMAD3蛋白的磷酸化，而RXR/RXR激动剂无此作用。. 3. RAR/RXR激动剂ATRA等通过上调BMP2促进hBMSCs的成骨分化，但同时激活TGFβ/SMADs和Wnts通路而抑制细胞钙化。RXR/RXR激动剂SR11237可促进hBMSCs由成骨分化向成脂分化转换，不激活TGFβ/SMADs和Wnts通路。. 4. 利用RNA-seq技术检测了RAR/RXR激动剂ATRA与RXR/RXR激动剂SR11237作用于hBMSCs成脂与成骨分化过程的mRNA及miRNA表达谱，明确了RAR/RXR和RXR/RXR通过作用于细胞内不同的信号通路及miRNAs调控细胞成脂及成骨分化。同时筛选了miRNAs的下游靶基因，初步明确了miRNAs与SMADs信号通路之间的关系。. 上述结果阐明了视黄酸信号通路调控hBMSCs成脂及成骨分化的分子机制，为探索骨质疏松的发病机制提供了有价值的线索。