验孕试纸用于乙肝病毒耐药突变基因的便携式体外分子诊断

The early discovery for drug-resistant mutation is important for the patients suffering from HBV, especially for China where HBV prevails. The current detection method has the disadvantages of high cost, complicated manipulation, time consuming, high misdiagnosis rate, and it usually requires special technology as well as the equipment. This project aims at detecting products of isothermal amplification of drug-resistance gene mutation via commercially available pregnancy test strip, which is realized by combining nucleic acid molecule circuit and novel detection nucleic acid probe, human chorionic gonadotropin (hCG)-DNA complex. The final purpose is to develop a new way to diagnosing drug-resistance gene mutation with cost-effectiveness and high working efficiency. The project goes with the tide of miniaturizing and integrating in the detection device to construct clinical accurate and general diagnosis platform under novel mechanism. The great demand for single molecular diagnosis with good sensitivity, selectivity and portability will be met through building the in vitro diagnosis (IVD) that integrating both sample processing and signal output. This project is beneficial for the development of IVD technology in our country, pushing forward the precise medical treatment based on molecule engineering. It provides guiding significance and new chances for valid convergence between fundamental research and application.

中国是乙型肝炎病毒（HBV）的高发国家，抗病毒药物耐药突变的早期诊断对于接受抗病毒治疗的乙肝患者至关重要。针对当前耐药突变基因检测方法成本高、技术和设备要求高、操作繁琐、耗时费力、误诊率高等问题，本项目拟将新型核酸检测探针——绒毛膜促性腺激素蛋白（hCG）-DNA缀合物和核酸分子线路结合，利用商品化验孕试纸来诊断HBV耐药突变基因的等温扩增产物，通过验孕试纸这种极具小型化和阵列化前景的检测方法来发展低成本、高效、简便的HBV耐药突变基因诊断新方法，为临床HBV的精准、普适化诊断平台的构建寻找理想的体外诊断新原理。通过研制相应检测试剂盒及装置并结合临床样本分析，搭建样品处理到信号输出一体化便携式体外诊断平台，满足HBV耐药突变基因低至单分子的灵敏、特异和便携的诊断需求，推动我国体外诊断技术的发展，加快分子工程深入精准医疗领域的步伐，为基础与应用研究的有效衔接提供新的契机和应用导向。

乙型肝炎病毒感染是世界范围内的公共健康问题，而抗病毒药物的治疗会使患者出现耐药突变，导致治疗失败。因此，耐药突变的早期诊断对于疾病控制具有重要意义。当前耐药突变基因检测方法存在成本高、技术和设备要求高、操作繁琐、耗时费力、误诊率高等问题。我们将蛋白质-核酸缀合物探针（hCG-DNA）与滚环扩增制备的微米级DNA纳米花结合起来，实现了验孕试纸对单碱基突变位点rtL180M的全均相免分离、便携化“信号开型”检测。在临床样本的测试中，试纸条检测结果与荧光检测法、直接测序法结果相匹配，具有可靠性与实际应用的潜力。我们进一步开发了与上述检测系统匹配的便携式诊断装置，借助于自制的微流控芯片以及先进的微加工技术，获得了“等温扩增-信号传导-验孕试纸检测”一体化便携式POCT装置，用于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）RNA的快速、可视化、超灵敏、特异检测。另外，将hCG-DNA缀合物探针引入到基于磁性纳米粒子的比色适配体生物传感器中，实现了基于验孕试纸的功能化核酸传感分析，普适于ATP、凝血酶、Ebola基因和BRAF基因等靶分子的检测。此外，本项目针对HBV单碱基耐药突变位点rtN236T设计了三通转导探针（3WJ），结合下游外切酶辅助的催化发夹自组装反应（EXO III-CHA），构建了电化学“信号开”型传感平台，实现了对rtN236T位点的灵敏、特异性检测，检测低至2拷贝/微升，且能够区分单碱基错配的野生型基因。为验证核酸分子线路的通用性，将环介导的等温核酸扩增（LAMP）与杂交链式反应（HCR）联用，设计了一种快速、实用的传感检测系统，用于诺如病毒的检测。检测信号强度与传统检测方法相比明显放大，并成功实现了对病毒样本从医院实验室检测到家庭检测的转化。相信以上工作会为基于验孕试纸的便携化应用打下坚实的基础，为开发便携化检测新方法提供思路指导。