肝脏组织工程猪去细胞化肝脏支架材料的免疫原性和肝细胞诱导性研究

Hepatic tissue engineering (HTE) includes extracorporeal bioartificial liver systems (BAL) and hepatocyte-based implantable tissue engineered liver (TEL), which are attractive alternative to adjuvant whole or partial liver transplantation or the temporary support for liver failure patients. Our preliminary studies have proved decellularized hepatic scaffold (DHS) provides suitable microenvironment for hepatocyte adhesion, survival and differentiation, which is an ideal scaffold for HTE research. Due to the clinical donor liver shortage, the HTE using DHS can only be considered an allogeneic source. Porcine liver is the best source for DHS for HTE application while the readily available and suitable size. But the heterologous immunity and immune rejection risk for clinical application should be considered. In this research, we will investigate the immunogenicity of porcine DHS form several decellulazation and modification methods systematically. At the same time, further explore the hepatic specific inducibility of DHS to establish an economic, simple, rapid and large-scale system for stem cells differentiation to hepatocytes. The achievements will provide experimental evidence and strong support for porcine DHS utilization in HTE research and clinical translation.

肝脏组织工程(HTE)研究的一个重要任务是为临床寻找全肝或部分肝移植替代治疗方案。目前主要研究方向包括体外生物人工肝支持系统(BAL)和植入式组织工程肝脏(TEL)。在前期研究中本课题组证明了去细胞化肝脏支架材料（DHS）能为肝细胞贴附、生存和分化提供良好的微环境，是HTE研究理想的支架材料。由于临床供肝严重短缺，因此HTE使用的DHS只能考虑异基因来源。而猪肝脏容易获取，大小与人肝接近，是HTE临床应用研究最佳的DHS来源，但其异种免疫原性使其临床应用存在免疫排斥风险。本研究将系统的研究去细胞化方法和材料修饰方式对猪DHS免疫原性的影响，以获得一种免疫原性小，临床使用安全的DHS。同时，进一步探讨和开发猪DHS的肝细胞特异诱导性，以获得一种经济、快速及大规模诱导干细胞分化为肝细胞的方法。为猪DHS在HTE研究和临床转化中的应用提供实验依据和有力支撑。

组织工程肝脏研究中去细胞支架材料上复合活细胞构建具有部分功能的“人工器官”是研究热点之一。并已成功构建有功能的生物心脏。在前期研究中，我们实验室首先制备了去细胞化肝支架，再将分离纯化的原代肝细胞复合到支架上，构建的组织工程肝可植入大鼠门静脉系统。结果表明可使90％肝切除的大鼠存活长达3天以上。该结果在Cell Transplantation上发表后，被Arch Toxicol杂志作为组织工程新进展进行介绍。在本项目研究中，我们成功制备了猪全肝去细胞化支架材料，并建立了制备猪全肝脱细胞化支架材料的标准化流程。在此基础上我们采用肝素末端连接的方式对猪全肝去细胞化支架材料进行了肝素化修饰，使材料获得了良好的抗凝性能，改善了其血液相容性。同时通过末端连接方式固定在支架材料上的肝素可以结合体液中游离的血管内皮细胞生长因子（VEGF），促进支架材料植入体内后的血管生成。另外，我们还发现使用新型低毒生物交联剂京尼平对猪全肝去细胞化支架材料进行交联修饰后，去细胞化支架材料的免疫原性明显降低。在结合去细胞化支架材料的优点与干细胞成球培养的特点，我们成功开发出一套干细胞向肝细胞高效定向诱导分化培养体系，并成功将人脐带间充质干细胞（UC-MSC）诱导成为肝细胞。以上成果为我们后续利用猪全肝去细胞化支架材料制造出适合临床使用的组织工程肝脏，提供了坚实的理论基础和技术储备。通过上述研究，课题组共发表了SCI全文论著5篇，投出SCI论文4篇，Medline论著1篇，中文核心期刊文章1篇，并申请中国发明专利2项，其中1项已经授权。因此，本项目在执行年度内严格执行申请标书的研究计划，并结合研究进展增加了部分内容，研究结果和结论与申请书中预期一致。