体细胞核移植培育CRISPR/Cas9技术敲除PERV基因克隆猪的研究

Nowdays, the best way to treat end-stage liver disease is liver transplantation, however the donor of liver is short .It is porcine organ that is the potential source to solve the problem. Porcine endogenous retroviruses that exists in the genome of pigs with multiple copies may cause biosafety in application of porcine organs . It is necessary to remove or suppress PERV in terms of biological security . CRISPR/Cas9 technology has strong ability in gene edited and can be used in knocking PERV out in order to reduce the risk of transmission between the species. In previous research, we have used the CRISPR/Cas9 technology successfully in knocking large pieces of PERV gene out .So this topic will keep doing the following research: 1) Detect the PERV knockout effect of cloned pigs ;2) Further knock out PERV and clone once more, develop a pig that PERV do not express or have no ability in infecting other species , then cultivate the cloned pigs in a large scale and lay a foundation for xenotransplantation.

同种异体肝脏移植是治疗终末期肝病的最佳方法，然而供肝来源匮乏。猪源器官是解决这一问题的途径之一，但猪体内存在内源性逆转录病毒（PERV），移植入体可能存在生物安全性问题，它是以多拷贝的形式存在于猪的基因组中。从生物安全性考虑，猪源器官使用前需要完全去除或抑制猪基因组内PERV。CRISPR/Cas9技术因具有较强的基因编辑能力，可应用于PERV关键基因的敲除， 使PERV失活，以降低其物种间传播的风险。前期研究中我们利用CRISPR/Cas9技术实现了对猪体细胞PERV基因的大片段敲除，降低了其拷贝数，并利用体细胞核移植技术培育出了克隆猪。在本课题中我们将开展以下研究：1）检测克隆猪中PERV敲除效果；2）在PERV部分敲除克隆猪的基础上进一步敲除PERV，并进行重复克隆，以培育出PERV不表达或者感染能力明显下降的克隆猪。本研究培育出的PERV感染力下降克隆猪，将为实现异种移植奠定基础。

在我国，因患者有各种器官衰竭而死亡的患者大约有150万，其中死于肝衰竭的患者大约有30万，治疗肝脏衰竭的方法主要有以下三种：1）内科综合治疗；2）生物人工肝支持治疗；3）同种异体肝脏移植；其中，内科综合治疗后患者预后较差，尤其是肝功Child-Pugh分级B级以下的患者，死亡率达到70%以上。生物人工肝支持治疗可利用具有功能的肝细胞进行解毒，维持患者生命，但适宜的功能肝细胞来源匮乏。同种异体肝脏移植是治疗终末期肝病的最佳方法，然而供肝来源匮乏。猪源器官是解决这一问题的途径之一，但猪体内存在内源性逆转录病毒（PERV），移植入体可能存在生物安全性问题，它是以多拷贝的形式存在于猪的基因组中。从生物安全性考虑，猪源器官使用前需要完全去除或抑制猪基因组内PERV。CRISPR/Cas9技术因具有较强的基因编辑能力，可应用于PERV关键基因的敲除， 使PERV失活，以降低其物种间传播的风险。我们利用CRISPR/Cas9技术实现了对猪体细胞PERV基因的大片段敲除，降低了其拷贝数，并利用体细胞核移植技术培育出了克隆猪，一共3头受体母猪，标号为：2号，3号，5号，共生出12头克隆猪，全部都为雌性，其中10头存活，2头死亡，对出生的12头克隆猪进行PERV敲除效果检测，发生了大片段大片段敲除，敲除得最大片段为1896bp。然后利用数字PCR方法检测出被敲除得拷贝数，被敲除得拷贝数在10-16拷贝之间。 然后分离出已进行敲除得猪胚胎成纤维细胞，再次进行PERV敲除，并进行检测，拷贝数较前第一次变化不大。我们对敲除后得猪胚胎成纤维细胞进行感染实验，证明了野生型PFF，各个阳性克隆猪分离出的PFF不感染人源细胞，PK15可以感染人源细胞。