miR160/164基因簇甜菜盐胁迫应答代谢通路的调控网络及作用机制研究

Researches on specific expression, target gene and gene function regulatory network of miRNAs have been hot spots in exploring the molecular mechanism against abiotic stress in plants, which also have great theoretical significance and application prospects in innovation of resilience material and molecular breeding. However, there are rare reports on relevant regulatory networks and mechanism so far. To clarify the function and regulation mechanisms of salt tolerance of miRNA in sugar beet, we analyzed and verified miRNAs in beet seedlings leaf under salt stress by high-throughput sequencing, finding that miR160 and miR164 have significant correlation with salt tolerance. This study intends to use the construction of VbMS, VIGS beet system, through beet seedlings degradation sequencing,miRNA and mRNA-miRNA interaction analysis combined with transgenic over-expression, RLM 5'-RACE and Real-time PCR and so on, silencing the gene cluster members of miR160/164 and their target genes, respectively, aiming to find miRNAs and its target genes which have core role in regulation network, or key function genes in miR160, miR164 family, to build related metabolic response to salt tolerance (such as proline, biosynthesis of betaine) regulatory pathway network, to provide new ideas on resilience molecular breeding.

特异表达miRNA及其靶基因与基因功能调控网络研究已成为探究植物抵御非生物胁迫分子机理的热点，在创新抗逆材料及分子育种中具有重大理论意义和应用前景。但目前有关调控网络及机理研究报道较少。为阐明miRNA在甜菜耐盐胁迫中的功能和调控机制，我们在前期对盐胁迫下甜菜幼苗叶片miRNA高通量测序分析与实验验证研究中发现miR160、miR164与甜菜耐盐有明显相关性。本研究拟深入开展甜菜幼苗miRNA与降解组测序及mRNA-miRNA互作分析，利用拟构建的甜菜VbMS、VIGS体系分别逐一验证miR160/164基因簇各成员及调控的靶基因，辅以转基因过表达、RLM 5’-RACE及荧光定量PCR检测等，找到miR160、miR164家族中核心调控的miRNA和受调控的核心靶基因及关键功能基因，初步构建盐胁迫应答相关代谢（如脯氨酸、甜菜碱等的生物合成）通路调控网络，旨在为抗逆分子育种提供新思路。

非编码microRNA及其调控的靶基因在植物非生物逆境胁迫应答中起重要作用。（1）本项目为鉴定盐胁迫应答的甜菜miRNA，对盐胁迫下甜菜幼苗miRNA测序，共鉴定出已知的miRNA 219个和新的miRNA 257个，有130条miRNA呈现差异表达。通过降解组测序和生物信息学分析，为317个miRNAs预测到了2534个靶基因，其中降解组测序为已知miRNA找到121个靶基因，为新miRNA找到50个靶基因。为探索盐胁迫下miRNA及其靶标在甜菜盐胁迫应答中的作用，我们对差异表达的miRNA及其靶基因(RNA-seq结果)的表达模式进行了综合分析，最终在根和叶中分别鉴定了242对和314对miRNA-mRNA互作对。有趣的是，降解组测序证实的12对靶标都是转录因子，说明转录因子在调控盐胁迫应答中有巨大潜力；还发现多个miRN以协同调控同一靶标，如miR164a/164e都可以切割NAC100。（2）通过转录组和表达谱测序及分子生物学验证实验，对差异表达显著的miR160(a,b,c,d)/miR164(a,b,c,d,e)家族及其靶基因家族成员（14个BvARF/54个BvNAC）进行了系统分析；筛选出miR160/miR164家族中参与盐胁迫的核心成员及7个候选耐盐相关 BvARF/12个候选耐盐相关 BvNAC基因；为进一步了解盐胁迫下BvNAC基因的分子机制，采用过表达方式验证了BvNAC的功能，证实了miR164与靶基因BvNAC在盐胁迫应答中的作用。（3）建立了甜菜重要功能基因鉴定平台——基于病毒沉默的VIGS技术体系，利用该平台验证了部分耐盐、耐旱等功能基因，可为甜菜抗逆分子育种提供有用的候选基因。（4）综合分析，初步构建了甜菜盐胁迫应答相关代谢通路（如植物激素信号转导、RNA降解、淀粉和蔗糖代谢等）调控网络，阐明了调控机制。（5）基于表达谱分析及qRT-PCR，我们还鉴定出一批耐盐相关转录因子，突出的有MYB基因72个，AP2-EREBP62个，bHLH60个，WRKY30个，GRAS 22个等，对其中bHLH、WRKY进行了相应的系统进化、基因结构及定量分析等分析，筛选出参与盐胁迫应答的BvbHLH基因10个和BvWRKY基因17个，为进一步验证耐盐功能的候选BvbHLH和WRKY转录因子奠定基础。