海洋细菌漆酶Lac15嗜卤素离子机制研究

Laccases (EC 1.10.3.2), multifunctional biocatalysts that catalyse oxidation of diverse substrates, have potential applications in many industries such as environment protection, medicine, textile and food. For application purposes, it is urgent to promote laccase activities under high concentrations of halides and/or salts. Typical laccases from plants and fungi easily lose activities upon exposure to halides/salts, whereas a few bacterial laccases tolerate and are even activated by high concentrations of halides/salts. Exploring the mechanisms underlying the halophilic character of laccases will be helpful to accelerate the process of laccases from theoretical study to industrial applications. Our pioneer work discovered a marine bacterial laccase (Lac15) with excellent halides/salts-tolerant ability. In the present application, we propose to use Lac15 as a model to investigate the halophilic mechanism of laccases. Lac15 will be subject to diverse assays including heat/chemical denaturation, site mutation, circular dichroism spectrum, fluorescence spectrum and 3-D crystallographic structure. It is anticipated to obtain key enzymatic parameters to elucidate the relationship of enzyme stability, 3-D structure, amino acid residues and the active site of electron transportation with the halophilic characters of laccases. Successful completion of the present program will guide development of laccases suitable for industrial applications.

漆酶（EC1.10.3.2）能够催化多种底物发生氧化，是高效的多功能生物催化剂，在环保、医药、纺织和食品加工等领域有广泛应用价值。但漆酶应用的推进迫切需要提高其在高盐/卤素离子等环境下的催化效率。植物和真菌漆酶的催化活性易受卤素离子抑制，某些细菌漆酶能耐受高浓度的盐，少数细菌漆酶的催化活性在一定浓度盐存在下还得到提升，细菌漆酶的这种嗜卤素离子性质对于漆酶的理论研究和实践应用都有重要意义，但目前对其嗜卤素离子机制的研究还未见报道。在前期工作中，本研究组发现海洋细菌漆酶Lac15具有优越的嗜/耐卤素离子特性，本项目拟以Lac15为研究对象，利用圆二色谱、荧光光谱和X-射线晶体解析等技术，结合热变性或化学变性以及定点突变等方法，通过考察酶的结构及其稳定性，以及相关质子/电子传递活性位点等与酶嗜卤素离子性质的关系，从生化和结构角度对其嗜卤素离子机制进行研究，为漆酶性质及其应用的理论和实践做出贡献。

漆酶（EC1.10.3.2）在广泛的工业领域有应用价值。某些应用需要漆酶在高盐等环境下保持催化活性，但植物和真菌漆酶的催化活性易受卤素离子抑制，而某些细菌漆酶则能耐受高盐甚至受盐促活。对这种嗜卤素离子性质机制的阐明对于漆酶的理论和应用都有重要意义，但目前这方面的研究鲜有报道。在前期工作中，本研究组发现海洋细菌漆酶Lac15具有优越的嗜/耐卤素离子特性。本项目计划利用结构生物学结合分子生物学和生物化学等方法，通过考察酶的结构及其稳定性以及质子/电子传递活性相关位点和因素等与酶嗜卤素离子性质的关系，揭示酶嗜卤素离子的分子机制。完成的主要研究内容和获得的主要成果如下：.（1）Lac15的结构及其稳定性与其嗜卤素离子性质的关系.通过监测Lac15的二级结构、三级结构和四级结构及其稳定性随卤素离子浓度的变化情况，考察酶的结构对卤素离子的依赖性，研究Lac15结构及其稳定性与其嗜卤素离子性质之间的潜在关联。结果显示，在促进酶活的盐浓度范围内Lac15的各层次结构及其稳定性没有明显变化，说明盐对Lac15的促活作用不是通过对整体结构的影响造成的，而是通过局部的特定位点引起的。这一成果已成文发表（Eur Biophys J, DOI 10.1007/s00249-017-1251-5）。.（2） Lac15参与质子/电子传递或其它关键残基与其嗜卤素离子性质的关系.通过检测各种特定位点如影响质子/电子传递及参与底物相互作用等关键位点的各种类型突变体的嗜卤素离子性质及酶活和动力学特征等，考察具体位点和因素的变化对酶的嗜卤素离子性质的影响，研究这些位点和因素与Lac15嗜卤素离子的关联。结果显示，虽然这些突变体的活性各异，但盐对它们的影响均与野生型Lac15相似，都在低浓度范围有不同程度的促活作用，说明Lac15嗜卤素性质是多位点多因素的综合作用，但相关位点和因素较多而且复杂，各位点和因素对嗜卤素性质的具体贡献有待进一步解析。.本项目的研究成果明确了漆酶Lac15的嗜卤素性质是由卤素离子与多个局部特定位点相互作用决定的，为未来进一步的相关理论研究和实际应用指明了方向。