糖苷水解酶GH97家族两种催化类型分化机制的研究

Glycoside hydrolases (GHs) catalyse hydrolysis of glycoside or transfer of aglycon in carbohydrate. They play important roles in organisms, and have significant application potential in industries such as fermentation and medicine, thus have been extensively studied. Glycoside hydrolases are classified into 129 families, and their catalytic mechanisms could be divided into two groups: retaining and inverting. Any of the GH families contain only one of the two mechanisms, except for GH97, whose members adopt either of them. Moreover, the activities of GH97 members are Ca2+ dependent, which is rare for other GH families. These indicate GH97 occupies a special position in GH evolution. However, how the two mechanisms developed and what role Ca2+ plays in it are unclear yet. To answer the questions, we plan, by rational design, site-directed mutagenesis, enzymatic and structural characterization of an inverting and Ca2+ independent GH97 member Pagl1, to investigate the biochemical and structural bases of catalytic mechanism divergency and Ca2+ dependencies of GH97 enzymes. Our results will contribute to reveal the evolution mechanism of GH97 family, and provide ground to engineering relevant GHs to improve their application potential.

糖苷水解酶通过催化碳水化合物中糖苷键的水解或糖苷转移，在生物体中扮演重要角色，也在发酵和制药等工业领域有巨大应用潜力，一直是酶学基础和应用研究关注的重点。迄今，糖苷水解酶共被划分为129个不同家族，其催化机制可分为保留和反转两种类型，同一家族酶一般只采用其中一种催化类型。特异的是，糖苷水解酶GH97家族同时拥有保留型和反转型成员，且表现出其它家族成员少见的Ca2+依赖性，这暗示其可能在糖苷水解酶进化中拥有特殊地位。不过，GH97家族的两种催化类型是如何分化而来？Ca2+是否在其中扮演重要角色？这些问题都有待解答。本项目拟以课题组前期发现的一个GH97家族新成员Pagl1为研究对象，通过理性设计和定点突变构建系列突变体，并对野生酶和突变酶的催化机制和Ca2+依赖性的生化及结构基础进行研究，为以上问题的解答提供依据，进而帮助揭示GH97家族的进化机制，也为相关糖苷水解酶的改造和应用奠定基础。

糖苷水解酶（Glycoside hydrolase，GH）通过催化碳水化合物中糖苷键的水解或糖苷转移，在生物体糖代谢中扮演重要角色，在工业领域有重要应用价值，一直是酶学基础和应用研究关注的重点。糖苷水解酶被划分为167个不同家族，其催化机制可分为保留和反转两种类型，同一家族酶一般只采用其中一种催化类型，但GH97家族酶同时拥有保留型和反转型成员，且表现出其它家族成员少见的Ca2+依赖性，暗示其可能在糖苷水解酶进化中拥有特殊地位。本项目以课题组前期发现的一个GH97家族新成员Pagl1为研究对象，通过解析Pagl1单体、与抑制剂阿卡波糖、酶活缺失突变体（E480Q）与底物潘糖以及氯离子结合位点突变体（R171K）的晶体结构，从原子分辨率水平揭示了Pagl1执行反转催化机制的酸碱催化位点、底物结合位点、钙离子结合位点以及氯离子结合位点，并阐述了Pagl1偏好水解底物α-1，6糖苷键以及受氯离子激活的结构基础。对所有已经解析的GH97家族成员的晶体结构，包括反转催化型的BtGH97a和Pagl1保留催化型的BtGH97b和BT3661进行比对分析，发现活性中心钙离子结合位点在GH97家族成员中高度保守，说明无论反转型还是保留型糖苷酶，Ca2+对于该家族成员的催化功能都是必需的。进一步对已有的海洋细菌来源的GH97家族成员进行序列比对发现，Pagl1结合氯离子的关键位点氨基酸残基R171在反转类型成员中高度保守，说明这些海洋细菌来源GH97家族的酶可能具有同样的被氯离子激活的性质和作用机制。通过理性设计和系列突变体构建，尝试将Pagl1的反转催化类型转变为保留类型，筛选并检测突变体酶活，未见有明显催化活性，说明Pagl1的催化功能是包括催化位点在内的多个位点协同完成，同时需要蛋白在更大范围形成严格的空间结构作为保障。