加味茵陈四逆汤对胆道闭锁模型小鼠肝纤维化TGF-β1/smads通道及MMPs/TIMPs的机制研究

Biliary atresia is one of the common causes of neonatal obstructive jaundice,At present，operation of Kasai is the main treatment .But it is difficult to prevent progressive liver fibrosis,and eventually lead to cirrhosis,how to slow down and reverse the process of liver fibrosis is the key point which can improve the prognosis. TGF-β1/smads channel plays an important role in activing the hepatic stellate cells and generating extracellular matrix in the process of liver fibrosis; Moreover,MMPs / TIMPs is an important system of regulating and removing excessive extracellular matrix in the body.Blocking signal transduction and adjusting the deposition of extracellular matrix of the channel can effectively delay the occurrence of liver fibrosis. On the basis of our previous studies. we will do experiments which include in vitro and in vivo by establishing Biliary atresia mice model : detecting TGF-β1、 Tβ1R、Smad3 / 7 、MMPs / TIMPs of liver tissue by Western Blotting ;detecting mRNA of Tβ1R、 Smad3/7 by RT-PCR;detecting MMPs/TIMPs mRNA of liver tissue In situ hybridization and making analysis of Image .Analysis; detecting the change in the amount of collagen by ELISA; revealing the mechanism and working target of Chinese medicine which can provid theoretical basis for clinical application.

胆道闭锁是新生儿和婴儿阻塞性黄胆常见的原因之一，Kasai术是目前最主要的治疗手段，但术后肝纤维化进程难以阻止，最终导致肝硬化，如何减缓、逆转肝纤维化进程是改善本病预后的关键。TGF-β1/smads通道在肝星状细胞的激活、细胞外基质的生成、肝纤维化进程中起着重要作用，而MMPs/TIMPs是机体内调节和清除过多细胞外基质的重要系统，阻断此通道的信号传导及调节细胞外基质的沉积可有效延缓肝纤维化的发生。本课题在既往研究基础上，通过建立胆道闭锁小鼠模型进行在体及离体实验：采用Western Blotting检测肝组织TGF-β1、Tβ1R、Smad3/7、MMPs/TIMPs，RT-PCR检测Tβ1R及Smad3/7 mRNA，原位杂交法检测肝组织MMPs/TIMPs mRNA并作图像分析，ELISA法检测胶原蛋白量的变化，研究加味茵陈四逆汤治疗本病的作用机制及靶点，为临床应用提供依据。

小儿胆道闭锁是儿科难治性疾病，预后不良，中医药防治小儿胆道闭锁Kasai术后肝纤维化的作用机制及靶点尚不明确。本项目在前期工作的基础上，通过研究加味茵陈四逆汤对胆道闭锁模型小鼠肝纤维化过程中的TGF-β1/smads通道及MMPs/TIMPs系统的影响，以及TGF-β1的下游通路中各因子的变化，研究其作用机制及作用靶点。首先，采用腹腔注射恒河猴轮状病毒诱导Balb/c 新生鼠胆道闭锁模型，给予加味茵陈四逆汤干预，发现加味茵陈四逆汤可能促进胆道闭锁小鼠的体重增长、降低肝指数、缓解肝脏汇管区炎症，降低肝组织中TβR1 mRNA及蛋白、smad3 mRNA及蛋白、TIMP1 mRNA及蛋白的相对表达量；其次，采用腹腔注射CCL4建立Wistar幼鼠肝纤维化模型，进一步发现加味茵陈四逆汤能不同程度上减轻幼鼠肝脏纤维化程度以及肝、脾指数，降低ALT、HA、LN、IV-C、PCOL-III，降低肝组织中TβR1 mRNA、smad3 mRNA及蛋白、smad7 mRNA、collagen I mRNA、collagen III mRNA及蛋白的相对表达量；第三，采用腹腔注射CCL4建立ICR小鼠肝纤维化模型，发现加味茵陈四逆汤可上调肝纤维化小鼠肝组织中MMP1 mRNA相对表达量，同时下调TIMP1 mRNA、TIMP2 mRNA的相对表达量；最后，采用TGF-β1诱导HSC-T6细胞模型，在加味茵陈四逆汤的含药血清培养下，观察到加味茵陈四逆汤对TβR1蛋白、smad3 mRNA及蛋白、collagen I mRNA、collagen III mRNA及蛋白均具有抑制作用。. 综上所述，轮状病毒诱导的胆道闭锁新生鼠模型及CCL4诱导的肝纤维化模型较好地模拟了人类胆道闭锁的过程。在胆道闭锁肝纤维化的进程中，可能存在TGF-β1/smads通路激活以及MMPs/TIMPs紊乱，而加味茵陈四逆汤可能具有延缓胆道闭锁肝纤维化进程的作用，可能是通过下调肝组织中TβR1的表达、减少smad3分泌，减轻collagen I和collagen III沉积，维持MMPs/TIMPs平衡而发挥抗肝纤维化作用的。