肠道共生菌的生物膜形式及其对对虾抗病的调控效应

Bacteria are able to grow adhered to abiotic surfaces and biotic layers, forming architecturally complex communities known as biofilms. When compared to planktonic cells, biofilm cells are highly resistant to many stresses, such as antibiotics, acid, high temperature, and bacteriophage infections. Intestinal commensal bacteria are microecology partners to host, they can interact directly with host and play important roles in intestnal immune system. It is an effective method to prevent and control shrimp disease by improving its intestinal microbial balance. Intestinal commensal bacteria predominantly exist in biofilms. The study of host disease resistant regulated by biofilm model can help to understand the mechanism of probiotic function of intestinal commensal bacteria. In our previous studies, some intestinal commensal bacteria have been isolated and shown disease protection for shimp. Based on this results, the biofilm-forming abilities of those strains and the multispecies biofilm formation will be further studied by 96-well microplate method, real time PCR, confocal laser scanning microscope, and green florescent protein (GFP)-based cellular assay. The biofilm of intestinal commensal bacteria and its regulatory effects on disease resistant of shrimp will be investigated by the studies on the immunology, microecology, pathology, and histology of the shrimp. This study can help to understand the function of bacteria in biofilm model, and it can provide a new way to prevent and control shrimp disease.

生物膜是细菌生活于生物材料或非生物材料表面时，形成的复杂微结构的细菌群落。形成生物膜的细菌在耐药、耐酸、耐高温、防噬菌体吞噬等生物学特性方面较游离态菌有更强的环境适应能力。肠道共生菌是与宿主直接作用的微生态伙伴，对维持肠道免疫系统功能具有关键性的作用。通过肠道共生菌改善对虾肠道内微生态平衡，将有效防控对虾疾病的发生。肠道共生菌常以生物膜形式存在，研究这种形式对宿主抗病力的影响将能从机制上揭示肠道共生菌的益生作用。本项目拟在本实验室对几株对虾肠道共生菌抗病作用的研究基础上，拟采用微孔板培养法、荧光定量PCR、激光共聚焦显微镜、绿色荧光蛋白标记等技术进一步评估对虾肠道共生菌生物膜形成能力及多菌株交互作用对生物膜形成的影响；从免疫学、微生态学、病理学和组织学的角度揭示肠道共生菌的生物膜形式对对虾抗病的调控效应。从群体角度认识共生微生物的生物学功能,为病害防治提供新思路。

肠道共生菌常以生物膜形式存在，研究这种形式对宿主抗病力的影响将能从机制上揭示肠道共生菌的益生作用。该项目筛选、分离鉴定了500余株海洋细菌，评估了两株溶藻胶弧菌的对对虾的抗病生物学功能，完成了一株潜在抗病菌Pseudoalteromonas (NJ289)基因组测序工作；建立了快速鉴别对虾肠道蜡样芽孢杆菌和溶藻胶弧菌的ELISA方法；评估了21株抗病候选菌的生物膜形成能力；建立了以几丁质为载体形成益生菌生物膜，以及涂布平板培养生物膜方法；建立了生物膜合成饲料制备方法；以口服免疫的方式评估了生物膜形式对对虾生长以及健康情况的影响，结果显示生物膜形式的免疫方式较游离态菌的形式对对虾生长率、蜕皮率、存活率、体重增长率、呼吸爆发以及免疫基因表达的都有促进作用；芽孢杆菌生物膜免疫凡纳滨对虾后，还实时监测了对虾肠道总菌群数、弧菌数以及芽孢杆菌数的动态分布过程；生物膜组对虾肠道芽孢杆菌数对数值最高为7.10cfu/g，游离态组芽孢杆菌数对数值最高为6.38cfu/g，对照组芽孢杆菌数对数值最高为4.85cfu/g；该项目并通过高通量测序方法验证了平板计数的结果；抗病候选菌免疫对虾后，经WSSV和致病弧菌攻毒实验，评估了单一抗病候选菌和复合菌生物膜形式的免疫保护功能；在WSSV攻毒实验中，单一菌和复合菌生物膜免疫组累计死亡率分别为78.00%和40.00%，单一菌和复合菌游离态菌免疫组累计死亡率为86.00%和60.00%，但是单一菌和复合菌对照组累计死亡率为96.00%和76.67%；在致病弧菌感染实验中，单一菌和复合菌生物膜免疫组累计死亡率分别为61.33%和35.00%，单一菌和复合菌游离态菌免疫组累计死亡率分为74.67%和55.00%，但是单一菌和复合菌对照组累计死亡率分为77.33%和62.50%；研究了抗病候选菌对凡纳滨对虾免疫作用调控机制，具体利用SDS-PAGE技术分析了生物膜菌与游离态菌蛋白成分的差异；通过SEM观察了抗病候选菌的可在几丁质上形成网状粘连生物膜形态；通过电镜观察到生物膜形式免疫组的对虾肠道沟壑明显多于游离态组、几丁质组和对照组，并发现菌落形态；通过PCR-DGGE分析对虾肠道菌群特征，发现生物膜免疫组抗病候选菌的含量显著高于游离态组和对照组；本项目通过研发抗病微生物生物膜制剂以及抗病机制研究，为预防对虾WSSV和致病弧菌病害发生提供新途径。