基于miR-145调控TGF-β/Smads信号传导探索川芎嗪延缓胆道闭锁肝纤维化的机制研究

Biliary atresia(BA) result in liver fibrosis is one of the important reasons for the children of end-stage liver failure, which can be effectively reduced by reversing or delaying hepatic fibrosis. Latest paper indicated that up-regulated miR-145 expression can inhibit the formation of hepatic fibrosis in children with BA, which mechanism was that the expression of target gene TGFR2 was inhibited, and then regulated the transmission of TGF-β/Smad signaling and ultimately regulated the fibrosis process. Our preliminary study found that ligustrazine can delay liver fibrosis. Therefore, we hypothesized that ligustrazine could delay the formation of fibrosis by affecting the expression of miR-145 and regulating the conduction of target signal TGF-β/Smad. Based on this, this study intends to carry out in vivo and in vitro experiment by applying miR-145 gene overexpression and silencing technology. The pathological changes of liver tissues were observed by light microscope and transmission electron microscope. RTCA, confocal microscope were used to research cell and Western blot and RT-PCR were used to analyze the expression of TβR2, p-smad2/3 and miR - 145, to explore the mechanism of ligustrazine on BA liver fibrosis, provide the theory of clinical treatment for the disease.

胆道闭锁(BA)肝纤维化是儿童肝衰竭重要病因之一；逆转或延缓肝纤维化可有效降低肝衰竭发生率。最新文献表明：上调miR-145表达可抑制BA患儿肝纤维化形成，其机制可能与miR-145抑制其靶基因TGFR2的表达，进而调节TGF-β/Smad信号传导，最终调节纤维化进程。课题组前期研究发现，川芎嗪具有延缓肝纤维化作用。因此我们提出假说：川芎嗪是否通过影响miR-145表达进而调节靶信号TGF-β/Smad的传导从而延缓纤维化形成？基于此，本研究拟通过BA肝纤维化模型在体实验及应用miR-145基因超表达及沉默技术开展离体实验；采用光镜及透射电镜观察肝组织病理变化；RTCA仪、共聚焦显微镜等对细胞进行研究及应用Western-blot、RT-PCR等对TβR2、p-smad2/3等蛋白及其基因和miR-145表达差异性进行分析，探索川芎嗪阻断BA肝纤维化作用机制，为本病临床治疗提供理论依据。

胆道闭锁(biliary atresia,BA)是目前一种病因尚不完全清楚、主要累及肝内、外胆管系统，导致新生儿及婴幼儿胆汁淤积性黄疸的疾病之一；本病在我国的的发病率约在1:5000～1:19000之间，且在亚洲国家如日本和我国的台湾地区的发病率较北美及欧洲要高。本病如不积极治疗，患儿会迅速向肝纤维化及肝硬化进展，通常不经治疗的患儿会在1～2年内死亡。肝门空肠吻合术(Kasai术)的开展极大的改善了患儿的临床症状及生存质量，但因其受多因素的影响，并不能阻止肝纤维化及肝硬化的发生；而且，在行肝门空肠吻合术且自体肝的胆道闭锁病例中，有接近98%的患儿具有不同程度的临床及实验室证据存在慢性肝损伤，最终需要肝移植治疗。然而，我国儿童肝移植技术开展较晚，加之目前供体肝源严重短缺以及昂贵的手术费用，使得本项技术不能广泛开展，因此， 探索有效的干预药物对本病的预后有着极其重要的临床及社会意义；本研究通过建立胆道闭锁动物模型及TGF-β诱导的肝星状细胞纤维化模型；探讨川芎嗪对乙醇诱导胆道闭锁大鼠模型及TGF-β诱导星状细胞活化细胞模型的治疗作用及其机制。将30只大鼠随机分为5组:对照组、假手术组、乙醇诱导胆道闭锁模型组、吡非尼酮模型组和川芎嗪模型组(每组6只)。采用HE、Masson染色和透射电镜观察肝脏的变化。检测miR-145和TGF-β/smads通路相关蛋白的mRNA和蛋白表达水平。 HSC-T6细胞分别用存在或不存在SMAD3抑制剂SIS3的LV-miR或rLV-miR-145感染，然后用2.5 ng/mL TGF-β1处理，再用川芎嗪处理。 采集细胞，检测miR-145和TGF-β/smads通路相关蛋白的mRNA和蛋白表达水平。 本研究结果显示：川芎嗪对乙醇引起的胆管损伤有明显的改善作用，其α-平滑肌肌动蛋白和I型胶原表达降低，肝脏组织和细胞形态完整。进一步实验表明川芎嗪可以抑制Smad2/3蛋白的表达和修饰； 在细胞中也得到了类似的结果。 此外，川芎嗪改变了动物模型和细胞模型中miR-145的表达。慢病毒介导的miR-145过表达和重组病毒敲除表明，miR-145通过调节TGF-β/Smad通路导致星状细胞的激活，川芎嗪可以阻断这种通路激活；本研究为肝纤维化的防治提供一种新的思路。