酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶电子传递通路研究与异源重建

中国维生素C（Vc）生产目前采用3株细菌参与的两步发酵工艺，第二步酮古龙酸菌催化山梨糖高效转化为2-酮基-L-古龙酸（糖酸转化）是中国两步发酵技术的主要优势和特色，负责糖酸转化的山梨糖脱氢酶（SDH）是一种醌酶，其电子传递机制尚不清楚。我们的前期研究发现异源宿主表达的山梨糖脱氢酶不能实现体内糖酸转化的障碍在于后续电子传递通路的阻断，并通过重建电子传递通路实现了糖酸的体外转化，从而推测山梨糖脱氢酶在酮古龙酸菌体内的电子传递通路为山梨糖脱氢酶→PQQ→细胞色素c→细胞色素c→细胞色素c氧化酶→O2。本项目拟通过酮古龙酸菌电子传递元件的提取纯化、异源表达、基因敲除、蛋白相互作用等手段，重建体内外山梨糖脱氢酶电子传递体系实现糖酸转化，进而阐明酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶生理电子传递通路并在异源宿主体内重建，为Vc一步发酵工程菌构建奠定基础。本项目对于醌酶电子传递机制和细菌呼吸链的研究也具有重要意义。

中国维生素C生产目前采用3株细菌参与的两步发酵工艺，第二步酮古龙酸菌催化山梨糖高效转化为2-酮基-L-古龙酸（糖酸转化）是中国两步发酵技术的主要优势和特色，负责糖酸转化的山梨糖脱氢酶是一种醌酶，其电子传递机制尚不清楚。课题前期研究发现异源宿主表达的山梨糖脱氢酶不能实现体内糖酸转化的障碍在于其后续电子传递通路的阻断。本研究首先在大肠杆菌中高效表达并纯化了山梨糖脱氢酶及细胞色素c551蛋白，通过体外糖酸转化实验证实山梨糖脱氢酶与细胞色素c551之间存在直接的电子传递。然后我们通过山梨糖脱氢酶晶体结构解析及定点突变后活性检测研究了山梨糖脱氢酶上底物、辅酶PQQ及c551结合及底物催化活性位点，说明山梨糖脱氢酶结合底物山梨糖后催化其脱氢，产生的电子传递给PQQ后再传递到细胞色素c551。进而我们构建了由山梨糖脱氢酶、辅酶PQQ、底物山梨糖、细胞色素c551以及真核生物线粒体细胞色素c及细胞色素c氧化酶组成的糖酸转化体系，成功实现了体外糖酸转化。进一步的实验证实提取的酮古龙酸菌膜蛋白组分能够代替真核生物线粒体细胞色素c及细胞色素c氧化酶完成体外糖酸转化，说明c551后续电子传递组分存在于酮古龙酸菌细胞膜上。接下来我们提取了及Trx共表达或GST融合表达与纯化酮古龙酸菌中细胞色素c552及细胞色素c氧化酶各组分进行体外转化实验，结合酮古龙酸菌体内基因敲除与SiRNA干涉实验结果，最终我们推测参与酮古龙酸菌山梨糖脱氢酶电子传递的组分包括山梨糖脱氢酶、细胞色素c551、细胞色素c552、细胞色素c氧化酶，电子传递通路为山梨糖→PQQ→细胞色素c→细胞色素c→细胞色素c氧化酶→O2。我们的实验也发现酮古龙酸菌中山梨醇脱氢酶、山梨酮脱氢酶与山梨糖脱氢酶有相同的电子传递通路，说明细胞色素c—细胞色素c氧化酶电子传递通路在酮古龙酸菌物质能量代谢中占有重要的地位。我们尝试将山梨糖脱氢酶及细胞色素c551基因转入到异源宿主脱氮副球菌及甲基营养菌中，在脱氮副球菌中能够检测到山梨糖脱氢酶的活性及培养上清中山梨糖的消耗，但没有发现酮古龙酸的积累。在该基金资助下，一共发表研究论文12篇，其中SCI论文4篇，均标注受到本基金资助。授权专利2项，培养博士生1名，硕士生6名，均已顺利毕业。