酮古龙酸菌醌酶－呼吸链电子传递系统的研究和原位重构

In the process of vitamin C two-step fermentation, L-sorbose is transformed into 2-keto-L-gulonic acid (2-KGA) under the catalysis of sorbose dehydrogenase or/and sorbosone dehydrogenase (pyrroloquinoline quinone-dependent dehydrogenases, PQDD), which are produced by Ketogulonigenium (called "small strain"). ROS (Reactive Oxygen Stress) might be one of the significant causes to restrict the independent growth of the small strain and its 2-KGA production, which lead to require accompanying strain cultivation in the industrial fermentation. According to our preliminary study, functional deficiency or functional insufficiency of the PQDD- respiratory chain electron transfer system is the reason of electron emission therefore ROS occurrence in the small strain. This system also has an impact on the electron transfer efficiency bring about poor growth and lower 2-KGA productivity. This project intends to compare and analyze the typical microbial PQDD electron transfer systems, to study the functional deficiency or functional insufficiency in the existing small strain (original mixture cultivation system) and a novel small strain (growth and 2-KGA production independent, obtained from our previous research). As our strategy, the in-situ gene recombination of the exogenous respiratory chain functional components into the Ketogulonigenium sp. will contribute to clarify how the functional components of the respiratory system make effect on the strain growth and 2-KGA production. Through these experiments, we expect to repair the PQDD- electron transfer system, decrease the ROS and finally improve the existing and/or novel small strain growth and 2-KGA production.

维生素C二步发酵过程中，L-山梨糖经酮古龙酸菌（小菌）山梨糖/酮脱氢酶（醌酶）作用转化为2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）。伴随的活性氧胁迫（ROS）是限制小菌生长和2-KGA产率（需与伴生菌混合培养发酵）的重要原因之一。本课题组前期研究认为，小菌醌酶－呼吸链电子传递系统存在功能缺陷是导致电子外溢，产生ROS的重要原因。同时该系统亦直接影响醌酶脱氢后电子传递效率，从而直接影响2-KGA产率。本项目拟通过比较分析微生物界存在的典型醌酶－呼吸链电子传递系统，研究原"混菌"发酵体系中小菌和本课题组前期发现的新小菌（独立生长、独立产2-KGA）体内该系统的功能缺陷。使用基因重组技术，将外源醌酶－呼吸链电子传递系统中各功能元件原位重组到原小菌/新小菌体内，阐述它们的功能以及对菌体生长与产2-KGA的影响机制。修复原小菌/新小菌的醌酶－呼吸链电子传递系统，减少ROS，促进菌体生长，提高2-KGA产率。

中国维生素C（VC）年产量在16万吨以上，占世界总产量的90%。现有的工业发酵为两步法，第一步是在氧化葡萄糖酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖。第二步是在一种混合菌系的作用下将L-山梨糖进一步氧化成VC的重要中间体2-酮基-L-古龙酸（2-KGA），最后经过化学转化使2-KGA生成VC。第二步发酵混合菌系中，L-山梨糖经酮古龙酸菌（小菌，需要巨大芽孢杆菌伴生）山梨糖/酮脱氢酶（醌酶）作用转化为2-酮基-L-古龙酸（2-KGA）。本课题研究发现，小菌醌酶－呼吸链电子传递系统存在功能缺陷是导致电子外溢，产生ROS，直接影响醌酶脱氢后电子传递效率，从而直接影响2-KGA产率。通过比较分析微生物界存在的所有典型醌酶－呼吸链电子传递系统，研究原“混菌”发酵体系中小菌（25B-1,又名SPU 805）和本课题组发现的新小菌（B003，能独立生长、独立产2-KGA）体内醌酶-呼吸链电子传递系统的组成，和各元件的功能，以及起关键作用的重要基因为SDH, SNDH, PQQ A-D, 细胞色素cyt C551，它们与小菌电子传递效率密切相关。通过重组到原小菌/新小菌体内，修复原小菌/新小菌的醌酶－呼吸链电子传递系统，减少ROS，促进菌体生长，提高2-KGA产率。.此外，本课题组进行了深刻的拓展性研究，发现新小菌与原小菌相比含有较多的tRNA和rRNA，有利于菌体蛋白质合成。含有较多的NAD和NADP合成基因，能够提供更多的还原力，在递氢反应中有重要作用。还有较多的细胞调控和信号基因，能够增强酮古龙酸菌对外部环境变化的反应能力。含有更完整的氨基酸合成系统。发现新小菌B003的糖代谢主要通过PPP和ED途径，为了降低在PPP氧化阶段和丙酮酸脱羧过程的碳损失，提高碳的利用率，构建了新的高效糖代谢途径，即XFP-PTA途径，可直接将己糖转化为化学计量单位的乙酰辅酶A，避免CO2的释放，降低碳损失，使碳代谢流有效地从L-山梨糖流向乙酰辅酶A。促进酮古龙酸菌生长，提高菌浓，2-KGA转化率显著提升，基本达到混菌工业发酵水平，颠覆现有的发酵生产模式，具有巨大的市场应用价值。