人源NAD依赖型异柠檬酸脱氢酶的结构和分子机制研究

NAD 依赖型异柠檬酸脱氢酶（NAD-IDH）是三羧酸循环中的限速酶，在生物的能量产生和合成代谢中起着十分重要的作用。人源 NAD-IDH 是由Alpha、Beta、Gamma 三个亚基以2:1:1 的形式组成的异源八聚体，在八聚体含有ADP/ATP、异柠檬酸、NAD、NADH以及Mn 结合位点。hNAD-IDH 异源八聚体和酵母以及其他低等真核生物的异柠檬酸脱氢酶的组成是不同的，其调控方式也更为复杂，是目前该类酶中唯一未被测定结构的蛋白复合体。运用结构生物学和生物化学的方法进行研究，通过测定不同复合物不同状态下的三维晶体结构，以及重要氨基酸突变体的酶反应动力学参数，系统地研究该类酶催化和调节的机理，有助于我们了解该酶家族在高等动物及人体内发挥生物功效的途径，具有重要的生物学意义和科学研究价值。同时该类酶的结构和功能研究，也为针对能量代谢异常相关疾病的药物开发提供指导，具有潜在的应用价值。

NAD依赖型异柠檬酸脱氢酶（NAD-IDH）是一类广泛存在于真核生物线粒体中的蛋白酶家族，是三羧酸循环的限速酶。该酶催化异柠檬酸氧化脱羧生成a-酮戊二酸，并将氧化型NAD+还原成NADH。该过程在真核生物的能量和物质代谢过程中发挥十分重要的作用。哺乳动物NAD-IDH是由a、b和g三种亚基以2:1:1的比例组装成a2bg，后者可以进一步二聚形成八聚体全酶。已有的生化数据表明：a亚基是催化亚基，参与底物、辅因子、金属离子的结合，而b和g亚基是调节亚基，可能具有结合调节因子的能力。另外，a和b亚基或者a和g亚基可以形成基本的结构单元，并分别具有一定的催化活力，但是它们的结构和功能的差异，以及全酶进行别构调节的分子机制还不清楚。.本项目以人源和爪蟾源NAD-IDH为研究对象，运用生物化学、分子生物学和结构生物学的方法，研究NAD-IDH全酶以及ab和ag亚复合物的酶学性质和分子结构。我们建立了该酶的活性及动力学测定体系，系统地测定了全酶以及ab和ag亚复合物的酶学性质，包括酶的比活力、最适pH、对金属离子的依赖性以及调节因子对这些参数的影响。我们对全酶以及ab和ag亚复合物开展了系统的结构学研究，解析了8种ag二元复合物结合不同配体的高分辨率晶体结构，包括g亚基不结合配体的结构，g亚基结合Mg2+和柠檬酸CIT的结构，g亚基结合Mg2+、CIT和ADP的结构，g亚基结合Mg2+、异柠檬酸ICT和ADP的结构，g亚基结合Mg2+、CIT和ATP的结构，g亚基结合NADP的结构，a亚基结合NAD的结构，以及一种ag二元复合物突变体的结构；解析了一种人源ab二元复合物的晶体结构和一种爪蟾源ab二元复合物结合辅因子NAD的晶体结构。我们还获得了a2bg全酶的晶体，并利用冷冻电镜技术对全酶的三维结构开展了研究。我们的工作首次阐明了两种结构单元ab和ag亚复合物在NAD-IDH全酶中发挥不同的生物学功能，从原子水平上阐明了它们发挥不同功能的结构基础；揭示了ag亚复合物识别和结合不同调节配体的分子机制和别构调节机制，以及在催化和别构调节过程中发生重要构象变化的分子机制。这些研究结果为进一步阐明高等生物中NAD-IDH全酶的结构和功能、以及催化机制和别构调节机制奠定了扎实的基础。