小地老虎翅发育基因的功能解析及其利用

The developmental mechanism of insect flying wing is the most thorough research on the the Drosophila melanogaster wing. While research on the developmental mechanism of agricultural pest flying wings is less. The aim of this project is to take Agrotis ypsilon wings as a research object, and select a series of wing development-related genes through transcriptome sequencing and comparison with Drosophila and Bombyx mori. With the aid of nanocarrier /dsRNA technology, the wing development related genes are disturbed, and the development of wing disc and the phenotype of adult wings are analyzed. On the one hand, we can understand the regulation mechanism of the Agrotis ypsilon wing development, on the other hand, provide us appropriate target genes for the RNA reagent to inhibit the Agrotis ypsilon wing development. The use of engineering bacteria in the low costs of mass production dsRNA, and the technology platform with nanocarrier delivering dsRNA into insect cells, we can overcome the difficult problem in the field that dsRNA can not effectively enter insect cells and play the role of gene interference. We will establish a technical scheme for the application of nanocarrier /dsRNA reagent in laboratory test and field experiment. This project not only contribute to the molecular mechanism of migratory insect wing development, but also can provide a solution for the real application of RNA reagent.

昆虫飞行翅的发育机理以果蝇Drosophila melanogaster的翅发育机理研究的最为深入，农业害虫飞行翅的发育机理研究较少。本项目拟以小地老虎Agrotis ypsilon翅为研究对象，通过转录组测序、与果蝇和家蚕Bombyx mori等基因序列的比对，筛选出一系列翅发育相关基因。借助纳米载体/dsRNA技术，对翅发育相关基因进行干扰，分析翅芽发育状况和成虫翅的表型。一方面理解小地老虎翅发育的调控机制，另一方面为抑制小地老虎翅发育的RNA制剂提供合适的靶标基因。利用工程细菌大批量低成本生产dsRNA，借助纳米载体运载dsRNA进入昆虫细胞的技术平台，能够克服农田施用dsRNA难以有效进入昆虫细胞、发挥基因干扰作用的难题。建立在室内生测和农田小区试验应用纳米载体/dsRNA制剂的技术方案。本项目不仅有助于理解迁飞性害虫翅发育的分子机理，还能为RNA制剂的实际应用提供方案。

生物机体的一部分在损坏、自然脱落或截肢之后全部或部分重新生成的现象被称为再生。昆虫在进化上和发育上与脊椎动物具有许多相似性，是在器官、组织、细胞和分子水平上研究再生过程与机理的理想对象。小地老虎幼虫的翅器官前体即翅芽能够再生缺失部分，正常长出成虫翅。从农业害虫研究来说，这对于小地老虎适应环境及保持翅功能完整具有重要意义，也是小地老虎迁飞能力的保证，另一方面也是对再生生物学的理论补充。.本研究主要有6方面结果：.1. 发现了小地老虎幼虫翅芽的再生能力随着龄期的增加而减弱。大面积剪切（1/3-1/2翅芽面积）4龄、5龄的幼虫左前翅翅芽，幼虫蜕皮化蛹及羽化均相对正常，再生的成虫翅与正常翅相比略小。而6龄幼虫再生翅面积大幅度减小。.2. 发现了小地老虎翅芽再生增殖活动是从减缓再恢复的一个动态过程。翅芽组织部分切除初期受到伤口的应激胁迫，增殖一度停滞，但48 h左右后与24 h时的增殖细胞相比，增殖细胞数量显著增加。同时，细胞骨架包括微管蛋白、肌动蛋白发生了重塑，呈现聚集形态。.3. 利用差异转录组分析获得了参与小地老虎翅芽再生生长的调控因子。发现了2282 个显著差异表达的基因，其中1604个基因表达上调，678个基因表达下调。其中通路中多数基因显著上调的MAPK通路是一个超级级联家族，在细胞生长、信号转导等细胞活动中都具有重要功能，因此选择MAPK通路及其他几个重要通路重点进行功能性分析。.4. 证明了MAPK通路部分基因在小地老虎翅再生过程起调控作用。RNA干扰实验证明了MAPK通路的三个重要基因Ay’Dsor1, Ay’Ras64B和Ay’Pka-C3能够影响翅芽再生。.5. 证明了MAPK通路重要基因 Ay’Dsor1, Ay’RAS64B and Ay’PKA-C3在再生过程中中调控细胞增殖。.6. 发现干扰基底金属蛋白酶Ay’MMP14基因能够影响翅芽再生生长。调控组织发育的Dpp信号通路的Ay’Smoc1等基因被干扰后，再生翅也受到影响变小。干扰JAK/STAT通路的Ay’ptpn11，调控组织发育的Hedgehog通路的Ay’Lrp2基因能够导致再生试虫蛹翅部位严重坏死。..本研究鉴定出大量与翅芽再生过程密切相关的分子路径和基因，其中MAPK信号通路通过调控细胞增殖来参与小地老虎翅芽早期再生。发现了一些基因适合研发RNA农药用于害虫防治