基于“凸凹互补”原理模拟组蛋白去乙酰化酶水解过渡态的选择性小分子探针

There are eleven isozymes of Zn-dependant histone deacetylase (HDAC) in human genome. To disclose the biological functions of each isoform, highly selective molecular probes,each of wich can only target one HDAC isoform, are proposed. First, a new pan-HDAC inhibitor molecular scaffold R-B(OH)Me is designed，via mimicking the substrate transition state in HDAC enzyme reaction. And then， based on the pump-and-hole principle, the pan-inhbitor R-B(OH)Me will be chemically modified and converted to pumped molecules, such as R-B(OH)-iPr and R-B(OH)-iBu. These pumped molecules cannot inhibit any wild type HDAC; however, it can solely target the mutant HDAC8 which coutains accomplementary "hole" struture to well accommodate the pumped moiety in the newly designed small molecular probes.In summary, our design is the first example to combine "bump-and-hole" and "mimicking transition state" strategies into molecular probe design. Although only HDAC8 is discussed in detail in this proposal, our methodology can be convenietly extended to design probes targeting any other Zn dependant HDAC isozymes. The protocol describe herein will not only provide powerful chemical biology tools in epigenetic studies, but also will highlight the molecular probe designs in other areas.

人源的组蛋白去乙酰化酶(HDAC)有11个含Zn离子同工酶，为了揭示它们各自的生物学功能，本课题设计了一类新型探针分子，能够靶向单一的某个突变HDAC亚型。由于这些同工酶的活性中心保守且催化机制相似，我们首先通过"模拟过渡态"设计了广谱选择性的HDAC抑制剂R-B(OH)-Me。然后基于"凸凹互补"原理设计了R-B(OH)-iPr和R-B(OH)-iBu等含有凸结构的HDAC探针分子：它们不能抑制所有野生型HDAC,但可以抑制含有"凹结构"的突变HDAC8。总之，我们的课题首次将"凸凹互补"和"模拟过渡态设计抑制剂"这两个传统的化学生物学的策略结合在一起，以HDAC8为切入点，探索建立一种专一靶向单一HDAC亚型的探针分子。我们的研究成果不仅为表观遗传学提供了重要的化学生物学工具，也为其它同工酶的探针分子设计扩宽了研究思路。

自然界中，常出现某一配体分子可被多个蛋白非选择性识别的现象；以此为基础，凸凹互补方法可人为设计出特异性互相识别的蛋白/配体组合，以利相关基础或临床研究。我们进行了两方面凸凹互补研究：HDAC8和半乳糖苷酶。前者为标书内容，我们已经成功找寻出特异性互相识别的凸凹互补对儿：HDAC8突变蛋白W141H和异戊酰基底物（Ac-RGK(isopenta)-AMU)。然后，我们改进了特异性抑制剂分子预案，合成了新探针分子。利用该分子探针，目前正和合作者结合生物质谱，进行HDAC8互作蛋白的蛋白组学研究，并进行初步的细胞生物学验证工作。通过对半乳糖苷酶及其NO糖苷分子的凸凹互补设计，实现体内可控NO释放以促进血管损伤大鼠的血管再生，该工作已经基本结束，预计2017年四月至五月投稿，研究内容包括：甲基化NO糖苷分子以及相关荧光和紫外探针分子合成，识别该糖苷分子的糖苷突变酶筛选，大鼠药代学评价，初步大鼠安全性评价，体内荧光成像评价，以及大鼠下肢缺血模型药效学评价。NO作为一种内源性多功能的信号分子，其临床应用多年来一直裹足不前。NO供体分子不能在体内可控释放是其原因之一。我们的研究是该领域的突破性进展之一。此外，在研期间，我们还进行了诸多HDAC相关的药物化学和化学生物学研究，包括：HDAC11表达研究，亚毫克级合成筛选HDAC抑制剂方法学，邻苯二胺类HDAC11慢结合抑制剂研究，以及利用野生HDAC8特异性抑制剂分子，通过合作，利用SILAC方法研究HDAC8的内源性底物蛋白。前三个工作已经结束，发表SCI一篇，正在审稿两篇。后一个工作，在我们工作临近结束之时，国外同行发表了及其类似的研究成果。