小地老虎性信息素受体PRs的分子克隆和功能分析

Agrotis ipsilon (Hufnagel) (Lepidoptera: Noctuidae) is a worldwide pest affecting multiple crops. Reproduction of this pest depends on smelling and recognition of female-released sex pheromone by male adults. However, our understanding of the molecular and cellular mechanisms of male perception of female sex pheromones is still limited. The insect sex pheromone receptors (PRs) are believed to play key roles to detect and sense the sex pheromone molecules. However, we know nothing about the gene identification and the biological functions of the A. ipsilon PRs. In this study, we will combine multiple techniques including molecular cloning, in situ hybridization, immunocytochemical localization, heterologous expression, cellular imaging, electrophysiological study, behavioral study and RNA interference (RNAi) to achieve the following three objectives: (1) Screening and cloning of candidate A. ipsilon PRs; (2) Investigating differential responses of PRs to A. ipsilon sex pheromone molecules and the interplay between PRs and pheromone binding proteins (PBPs) using heterologous expression system in Xenopus oocytes and insect Sf9 cells at cellular level; (3) Testing the impacts of RNAi knockdown of the candidate PRs on the electrophysiology, calling and mating behaviors of male adults. Accomplishment of this project will enhance our knowledge of the molecular and cellular basis of insect sex pheromone communication, more importantly, can provide us novel methods, such as RNA interference, to control insect pest through disrupting the male perception of female pheromone.

小地老虎是世界上多种作物的重要害虫。小地老虎雄蛾对性信息素具有极高的趋性，但雄蛾识别性信息素的分子和细胞机制还不清楚。性信息素受体pheromone receptors(PRs)在昆虫感受性信息素过程中起关键作用。而小地老虎PRs的分子鉴定及在性信息素识别中的作用还未可知。在本项目我们将综合用分子克隆、原位杂交、免疫组化、异源表达、细胞成像、电生理、行为学和RNAi技术完成3个目标：(1) 筛选并克隆小地老虎PRs基因；(2) 通过爪蟾卵母细胞和昆虫Sf9细胞表达平台，在细胞水平研究PRs对性信息素分子的识别反应以及同性信息素结合蛋白PBP的互作关系；(3) 通过RNAi技术研究缺失表达PRs后在电生理和行为学水平对小地老虎求偶交配的影响。本项目的完成有利于阐明昆虫性信息素通讯的分子和细胞机制。更重要的是，可以为我们提供新的方法如通过RNAi干扰靶标害虫性信息素识别进而达到有效防治的目的。

小地老虎是世界上多种作物的重要害虫。小地老虎雄蛾对性信息素具有极高的趋性，但雄蛾识别性信息素的分子和细胞机制还不清楚。性信息素受体pheromone receptors(PRs)在昆虫感受性信息素过程中起关键作用。而小地老虎PRs的分子鉴定及在性信息素识别中的作用还未可知。在本项目中我们综合用分子克隆、原位杂交、免疫组化、异源表达、细胞成像、电生理、行为学和RNAi技术得到如下结果：(1)从小地老虎触角中鉴定了气味受体OR基因42个，其中包括1个非典型嗅觉受体Orco, 41个典型的嗅觉受体ORs。(2) 半定量RT-PCR和荧光定量qRT-PCR结果显示35个ORs基因特异性或主要在雌雄蛾触角中表达，其中性信息素受体PRs 5个，4个PRs基因(OR1, OR3, OR4和OR14)特异性地在雄蛾触角中表达，表明这些PRs在小地老虎识别性信息素过程中起关键作用。(3)双电极电压钳结果显示表达PRs的爪蟾卵母细胞对小地老虎5种性信息素呈现不同的反应图谱，性信息素受体OR3特异性识别主要的性信息素组分Z7-12:Ac, 在Z7-12:Ac浓度为10-4 Mol/L的刺激下, 表达OR3的卵母细胞的电流平均值能达到5100 nA, 性信息素受体OR1特异性识别小地老虎主要的第二主要性信息素组分Z9-14:Ac, 在Z9-14:Ac浓度为10-4 Mol/L的刺激下, 表达OR1的卵母细胞的电流平均值为1335 nA. 性信息素受体OR4特异性识别小地老虎次要性信息素组分Z5-10:Ac, 在Z5-10:Ac浓度为10-4 Mol/L的刺激下, 表达OR4的卵母细胞的电流平均值为362 nA. (4) RNAi结果显示注射dsRNA OR3和ORco (每个注射15µg dsRNA) 72小时后其表达量下降为原来的30%左右, 表明RNAi显著抑制了主要性信息素受体OR3和ORco的表达。昆虫触角电位仪观察RNAi干扰OR3和Orco之后对性信息素的EAG反应显示，混合注射OR3和ORco后，雄性小地老虎触角对性信息素主要组分Z7-12:Ac的EAG值下降到原来的25%. 本项目的完成有利于阐明昆虫性信息素通讯的分子和细胞机制。更重要的是，可以为我们提供新的方法如通过RNAi干扰靶标害虫性信息素识别进而达到有效防治的目的。