内源性大麻素系统在胆道恶性肿瘤中的表达规律及调控机制研究

Biliary tract cancer (BTC) is a devastating disease affecting human health. Endocannabinoids (eCB) are endogenous ligands of the cannabinoid receptors which share similar molecular structure with tetrahydrocannabinol, the main psychoactive component of marijuana. Endocannabinoid system (ECS) consist of cannabinoid receptors, eCB and related biosynthetic and degradative enzymes. Prof. S DeMorrow and colleagues previously found that arachidonoyl ethanolamide (AEA), one type of eCB, exerts pro-apoptotic effect on BTC through undetermined mechanisms. Moreover, our cooperational published data with Prof. DeMorrow's group had shown that AEA can selectively activate Notch 1 pathway to induce apoptosis on BTC. We had also identified G-protein coupling receptor 55 (GPR55) as the bona fide receptor mediating aforementioned effect of AEA. On the other hand, 2-arachidonoylglycerol (2-AG), another eCB, promoted BTC proliferation.Furthermore, we had also found that fatty acid amide hydrolase (FAAH), the degradative enzyme for AEA was up-regulated in BTC. Judging from above, we hypothesize that there was a dysregulated ECS in BTC tumor microenvironment with local down-regulated AEA or up-regulated 2-AG; intervention of this dysregulated ECS by elevating AEA or reducing 2-AG may inhibit BTC development. Present study aims to explore the expression profile and regulation of ECS in BTC by techniques inculding gas chromatography - mass spectrometry apparatus analysis, western blot, shRNA transfection, in situ BTC and xenografted BTC animal models et al. Intervention effects will be also evaluated. Present study may provide evidence and reveal the role of ECS in surveillance and therapy for BTC.

胆道恶性肿瘤(BTC)是严重危害人类健康的疾病。内源性大麻素（eCB）是与大麻提取物四氢大麻酚结构相似的内源性脂质；内源性大麻素系统（ECS）包括大麻素受体、eCB及相关代谢酶。S DeMorrow教授课题组首次发现,eCB中的AEA可诱导BTC凋亡，机制未明。我们与该课题组后续的合作研究发现，AEA可激活Notch 1通路诱导BTC凋亡；介导AEA上述作用的受体为GPR55；eCB中的2-AG促进BTC增殖。另外我们还发现AEA分解酶FAAH在BTC中表达上调。由此我们推测：BTC微环境中ECS调控异常；局部微环境AEA减少或2-AG增多；干预该ECS可抑制BTC生长。本研究拟采用气相色谱质谱联用仪检测、Western blot、shRNA转染、原位BTC及皮下移植瘤动物模型等技术探讨BTC中ECS的表达规律与调控机制及干预效果。本研究可为ECS在BTC监测与治疗中的意义提供理论依据。

本课题组采用人原代肝内胆管上皮细胞（HiBec）和人永生化良性胆管上皮细胞株（H69）、人胆囊癌细胞株（Mz-ChA-1、QBC）、人肝外胆管癌细胞株（TFK、FRH）和人肝内胆管癌细胞株（CCLP、RBE、HCCC）；采集胆道良性疾病（n=8）及恶性胆道肿瘤（n=22）患者的血浆及胆汁；采集胆道恶性肿瘤患者（n=15）癌巢及癌旁良性组织，使用BD抽提法（氯仿+甲醇）配合C-18 Sep-Pak萃取柱进行固相萃取，提取上述细胞、组织及液体样本中的脂质，采用二甲基异丙基硅烷-咪唑（DMiPSi imidazole）对脂质进行硅烷化衍生，配合同位素氘标记的内参（AEA-d4和2-AG-d5）及QP-2010气相色谱-质谱联用仪（GC/MS检测仪，岛津），检测内源性大麻素（eCB）的表达水平。结果显示：与良性胆管细胞株相比，恶性胆道肿瘤细胞株胞内AEA的含量较低，2-AG则相反。与良性胆道疾病患者相比，AEA在胆道恶性肿瘤患者的血浆及胆汁中的浓度降低，在胆汁中的差异具有显著性；与周围正常组织相比，AEA在癌巢中的含量水平显著降低。与良性胆道疾病患者相比，2-AG在胆道恶性肿瘤患者的血浆及胆汁中的浓度升高，在血浆中的差异具有显著性；与周围正常组织相比，2-AG在癌巢中的含量水平显著升高。采用实时定量PCR、Western blot及免疫组织化学染色检测AEA降解酶FAAH-1和FAAH-2、2-AG合成酶DAGLA和DAGLB、2-AG降解酶MAGL在胆道良恶性细胞株、患者病理组织中的表达水平。结果显示，在胆道恶性细胞株及患者病理组织中，上述代谢酶的表达均显著上调。进一步我们采用特异的化学抑制剂及基因特异shRNA敲减技术，配合GC/MS检测，在国际上首次证明FAAH-1是胆管良恶性组织中降解AEA的主要代谢酶； DAGLA和DAGLB是胆管良恶性组织中合成2-AG的同工酶，DAGLB起主要的作用。化学试剂抑制或shRNA敲减FAAH-1或DAGLB，均可显著抑制胆道恶性肿瘤细胞株的增殖、迁移及侵袭。在临床样本中，AEA在癌巢中的含量降低、2-AG在血浆及癌巢中的含量升高及上述代谢酶在癌巢中的高表达，均与肿瘤的侵袭性及临床分期相关。上述研究结果已被2015年美国肝脏病研究会年会收录并以会议壁报形式展示，相关研究内容以会议摘要形式收录在2015年《Hepatology》增刊。