古菌真核类型引发酶的亚基性质与功能演化的研究

Archaea possess a DNA replication apparatus similar to that of Eukarya but distinctly different from that of Bacteria. DNA primases from Archaea and Eukarya belong to the archaeo-eukaryotic primase (AEP) superfamily, while bacterial primases are members of the DnaG superfamily. Until recently, an archaeal AEP was considered to be a heterodimer (PriSL) of a catalytic subunit (PriS) and a noncatalytic subunit (PriL). Our laboratory has recently shown that a number of archaea encode PriX, a novel noncatalytic primase subunit, or its homologue. We have also found that PriSL from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus is capable of template-dependent polymerization across discontinuous templates. This observation has led to the suggestion that the enzyme participates in the nonhomologous end-joining (NHEJ) repair of DNA double-strand breaks (DSBs). We have further speculated that the last universal common ancestor (LUCA) possessed both an AEP and a DnaG. This project will assess, using Sulfolobus as a model, the structural and biochemical diversity of PriX and its homologues, elucidate the roles of archaeal AEPs in DNA replication and DSB repair, and shed light on the functional evolution of this protein superfamily. The implementation of the project will help solve the puzzle of the evolution of multiple functions of AEPs.

古菌拥有与真核生物类似、而与细菌截然不同的DNA复制机器。古菌与真核生物的引发酶同属于古菌-真核生物引发酶（archaeo-eukaryotic primase, AEP）超家族，而细菌引发酶则属于DnaG超家族。此前，古菌AEP被认为是仅含催化亚基PriS和非催化亚基PriL的异二聚体PriSL。本实验室近期发现，部分古菌编码一种新的引发酶非催化亚基PriX或其同源蛋白；此外，还发现极端嗜热古菌—硫化叶菌PriSL具有依赖模板的跨模板合成能力，因而有可能参与DNA双链断裂的非同源末端连接修复。本实验室根据已有结果推测，最后的共同祖先拥有AEP和DnaG双引发酶系统。本项目拟以硫化叶菌为模式，阐明PriX及其同源蛋白的结构与生化性质多样性，解析古菌AEP在DNA复制和DNA双链断裂修复过程中的作用及其机制，揭示古菌AEP的功能演化规律。本项目的实施有助于破解AEP多种生理功能的演化奥秘。

古菌拥有与真核生物类似、而与细菌截然不同的DNA复制机器。古菌与真核生物的引发酶同属于古菌-真核生物引发酶（archaeo-eukaryotic primase, AEP）超家族，而细菌引发酶则属于DnaG超家族。此前，古菌AEP被认为是仅含催化亚基PriS和非催化亚基PriL的异二聚体PriSL。本实验室的研究发现，部分古菌编码一种新的引发酶非催化亚基PriX或其同源蛋白；此外，还发现极端嗜热古菌—硫化叶菌PriSL具有依赖模板的跨模板合成能力，因而有可能参与DNA双链断裂的非同源末端连接修复。本项目以硫化叶菌为模式，对不同古菌来源的PriX及其同源蛋白的结构、生化性质和生理功能进行了深入研究，取得了以下主要进展。（i）在PriX及其同源蛋白的多样性及功能演化方面，分析了冰岛硫化叶菌（Sulfolobus islandicus Rey15A）中不同形式引发酶复合物的功能，重点研究了引发酶非催化亚基PriL的C端结构域（PriL-CTD）的功能，发现PriL-CTD中高度保守的铁硫簇对于引发酶的引发功能并非必需；对来源于东工大硫化叶菌（Sulfolobus tokodii，现称为Sulfurisphaera tokodaii）的PriX同源蛋白StoPriSX展开了系统研究，分析了其DNA复制和修复相关生化活性，结合遗传学研究，推测StoPriSX可能参与DNA修复。（ii）在DNA复制方面，确定了硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus sofataricus P2，现称为Saccharolobus solfataricus P2）引发酶亚基PriS、PriL和PriX在细胞内的定位以及在不同生长时期中的含量变化；鉴定了硫磺矿硫化叶菌DNA复制体复合物中与引发酶相互作用的蛋白，并对其互作进行了体外验证。（iii）在DNA修复方面，构建了冰岛硫化叶菌引发酶的多个突变体菌株，并对其进行了DNA损伤修复相关表型分析；揭示了与引发酶相关的DNA复制和修复蛋白互作网络。综上，本项目深度揭示了PriX影响古菌引发酶引发活性的分子机制，解析了含有PriX同源结构域古菌引发酶的性质和结构的多样性，揭示了硫化叶菌引发酶在DNA复制与修复过程中的作用及其机制，增加了对古菌AEP功能及其演化规律的认识。