探讨nNOS诱导的PKM2亚硝化（S-nitrosylation）对卵巢癌糖酵解和肿瘤生长的调控作用及机制

One of the fundamental properties of cancer cells is that they underwent metabolic reprogramming from oxidative phosphorylation to aerobic glycolysis during carcinogenesis. Pyruvate kinase M2 (PKM2), a rate-limiting enzyme in the last step of glycolysis, exerts an important role in glycolysis and tumor malignancy. Our previous work showed that neural nitric oxide synthases (nNOS) is upregulated in human ovarian cancer and induces PKM2 S-nitrosylation, a reaction that coupling of a mitroso moiety to a reactive thiol group in specific cysteine residues leading to the formation of an S-nitrosothiol (SNO). However, the functional and clinical significance of PKM2 S-nitrosylation has not been studied. Here we aim to explore the role of nNOS induced S-nitrosylation of PKM2 on glycolysis and ovarian cancer progression. The specific aims are: 1) identify the S-nitrosylating site of PKM2 through mass spectrum method. 2) establish PKM2-knockout ovary cancer cell lines overexpressing S-nitrosylation mimetic- or deficient PKM2 cDNA plasmid by using CRISPR-Cas9 and site-directed mutagenesis technologies. 3) analyze the role of PKM2 S-nitrosylation on glycolysis flow in SNO-mutant ovary cancer cells with GS-MS methods. 4) study the role of PKM2 S-nitrosylation on PKM2 function in vitro and in vivo. 5) explore prognostic and diagnostic roles of PKM2 S-nitrosylation in ovarian cancer patients. The proposed research will not only lead to a better understanding of NOS-induced PKM2 S-nitrosylation on tumor progression, but also provide potential prognosticator for ovarian cancer.

恶性肿瘤中糖酵解增强，为其无限制增殖提供能量、生物大分子前体及抗氧化物质。丙酮酸激酶(PKM2)是肿瘤糖酵解途径中的限速酶之一，受多种翻译后修饰作用通过改变其活性调控代谢重编程。一氧化氮合酶(NOS)催化一氧化氮(NO)合成，通过亚硝化(S-nitrosylate)修饰靶蛋白促进肿瘤恶性进展。本课题组前期实验证明nNOS在卵巢癌中高表达，可结合并亚硝化PKM2。因此，我们推测nNOS通过亚硝化PKM2促进肿瘤糖酵解和细胞增殖。为此，本研究旨在1）利用质谱技术鉴定出PKM2亚硝化位点；2）构建PKM2亚硝化突变的卵巢癌细胞株，3）体内、外水平研究PKM2亚硝化对糖代谢流和细胞增殖的调控作用及机制；4）临床分析PKM2亚硝化与卵巢癌患者进展预后的关系并筛选亚硝化差异的代谢酶谱。本课题将探讨nNOS诱导的PKM2亚硝化对卵巢癌糖酵解和细胞增殖的调控作用和机制，为寻找卵巢癌诊断及治疗提供理论依据。

正常细胞向恶性细胞的转化过程中伴随着能量代谢重编程，不同于正常细胞利用葡萄糖进入三羧酸循环产生 ATP， 肿瘤细胞在有氧和无氧条件下均利用葡萄糖产生乳酸（Warburg effect） 并且依赖谷氨酰胺回补三羧酸循环。PIK3CA是突变频率较高的癌基因之一，其突变可通过激活AKT/mTOR等信号驱动肿瘤细胞转化。与野生型细胞相比，PIK3CA突变后对生长因子依赖性降低，抗凋亡能力增强。研究表明PIK3CA突变是致瘤表型的关键驱动因素，鉴于目前PIK3CA抑制剂临床应用有限，因此需要开发PIK3CA突变的特异性抑制剂。.本研究中，1.我们首先检测PIK3CA突变卵巢癌细胞A2780和肺癌细胞H460，PIK3CA野生细胞卵巢癌细胞OVCAR3和肺癌细胞A549增殖情况，发现与PIK3CA野生型卵巢癌和肺癌细胞相比，PIK3CA突变卵巢癌和肺癌细胞增殖能力增强。通过seahrose实验发现与PIK3CA野生型细胞相比，PIK3CA突变细胞的糖酵解水平及有氧氧化水平均显著增强。通过转染慢病毒分别建立卵巢癌、肺癌PIK3CA突变稳定细胞株（A2780E545K，A549E545K）也得到类似的结果。2. 我们进一步发现，SFN可抑制卵巢癌和肺癌细胞增殖，降低糖代谢（糖酵解和有氧氧化）及糖代谢相关酶表达，且在PIK3CA突变的细胞中更明显；SFN通过抑制PI3K/AKT通路，选择性抑制PIK3CA突变细胞糖代谢与增殖。3.质谱分析显示，较野生细胞相比，PIK3CA突变细胞更依赖于糖酵解而非谷氨酰胺回补TCA循环，而谷氨酰胺可能更多用于产生GSH用于抗氧化压力。4.质谱分析显示SFN作用后，a-KG和琥珀酸降低，柠檬酸、异柠檬酸、谷氨酰胺不变，谷氨酸增强。进一步证实，SFN通过ATF下调SLC7A11表达，增强抗氧化能力，同时有可能通过谷氨酰胺回补TCA。5.SFN联合谷氨酰胺阻断剂CB839较SFN单药组更能抑制肿瘤生长。该研究探讨PIK3CA突变对糖酵解、有氧氧化和谷氨酰胺代谢的影响，阐明SFN通过PIK3CA/ATK选择性抑制PIK3CA突变肿瘤糖酵解，并通过ATF/SLC7A11抑制肿瘤抗氧化能力；为莱菔硫烷联合谷氨酰胺阻断剂CB839特异性抑制PIK3CA突变肿瘤提供理论依据。