趋化因子XCL1在嵌合抗原受体T细胞相关细胞因子释放综合征中的作用及机制研究

Cytokine release syndrome (CRS) is the major complication after chimeric antigen receptor T cell (CART) therapy. Recent researches showed that cytokines and chemockines play important roles in CRS pathogenesis. In our previous research we found the serum level of chemockine XCL1 were greatly increased in CRS peak stage in constrast to that before CRS and CRS restoration, what's more, we found XCL1 expression in CD8+ T cells and CART19 cells were greatly increased. Migration and activation of the T cells were the direct causes of CRS. Our preliminary data found that XCL1 blockage can mitigate CRS implying that XCL1 played important roles in CRS pathogenesis. The current study will first verify XCL1 have important roles in CRS pathogenesis. Next we will clarify the roles and mechanisms of XCL1 in T cell migration via cell-cell co-culture. Finally the roles and mechanisms of XCL1 in T cell non-specific cell activation by cytokines and DC-mediated T cell specific activation were clarified. The research can lay the foundation for novel mechanisms of CAR-T associated CRS. And also the research will provide novel targets for CRS treatment.

细胞因子释放综合征（CRS）是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗的主要并发症。新近发现细胞因子和趋化因子在CRS发病中起重要作用。前期血清细胞因子芯片发现趋化因子XCL1在CRS高峰期明显升高，CD8+T和靶向CD19的CAR-T(CART19)为CRS主要效应细胞且细胞表面高表达XCL1，该细胞迁移至白血病部位并被活化释放细胞因子是CRS发生的直接原因。预实验表明，CRS模型中阻断XCL1能减轻CRS，提示XCL1在CRS中起重要作用。本项目先在CRS小鼠模型中利用XCL1阻滞剂和重组XCL1验证XCL1在CRS中的作用，利用细胞共培养阐明XCL1促进T细胞迁移的作用及机制，流式细胞术、免疫印迹等明确XCL1在CART19及CD8+T细胞经细胞因子介导的非特异性活化和DC细胞介导的特异性活化中的重要作用和机制，为阐明CRS发病机制提供实验依据，为发现CRS新型治疗靶点奠定基础。

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法是治疗血液系统恶性疾病的有效手段，而细胞因子释放综合征（CRS）是主要并发症，成为阻碍CAR-T细胞疗法进一步推广的关键因素之一。近年来研究发现，细胞因子和趋化因子在CRS的发生发展中具有重要作用，但具体机制尚未明确。趋化因子XCL1作为C亚族趋化因子家族中的一员，主要由活化的CD8+T细胞和NK细胞产生，在免疫反应诱导炎症细胞活化和迁移的过程中发挥显著作用。在许多免疫性疾病，如乙型肝炎、类风湿性关节炎、慢性阻塞性肺病中，XCL1均发挥关键作用。因此，我们推测趋化因子XCL1诱导CAR-T细胞和CD8+T细胞等免疫细胞的过度活化和迁移是CRS的发生发展过程中的机制之一。在本研究中，我们首先通过血清细胞因子/趋化因子蛋白芯片、酶联免疫吸附测定（ELISA）、流式细胞术对临床上CAR-T细胞治疗ALL后有无发生CRS的患者中趋化因子XCL1及其受体XCR1的表达水平和表达范围进行检测，发现重度CRS的患者相比于无CRS或轻度CRS患者的血清中XCL1的含量显著升高，同时重度CRS患者CAR-T细胞表面XCR1表达水平显著高于无CRS或轻度CRS患者。进一步，我们通过建立CAR-T细胞治疗急性淋巴细胞白血病诱发CRS的小鼠模型，利用转录组测序技术（RNA-seq）和单细胞转录组测序技术（scRNA-seq），发现小鼠体内CAR-T细胞及CD8+T细胞中XCL1的表达水平随着CRS反应逐渐增强而增强，随着CRS的恢复而逐渐下降，呈现动态过程。同时，骨髓中CAR-T细胞XCL1表达水平高于外周血，提示XCL1可能促进CAR-T细胞从外周血向骨髓迁移。最后，我们通过体外应用重组人XCL1蛋白和内源性敲降XCL1的CAR-T细胞，发现XCL1在CAR-T细胞和CD8+T细胞的活化、杀伤和迁移过程中具有重要作用，通过与DC细胞互作、JAK/STAT、PI3K/AKT和Ras/MAPK信号通路以及粘附分子参与介导，并且阻断XCL1功能或降低XCL1表达后，能显著抑制CAR-T细胞和CD8+T细胞活化、杀伤和迁移功能。综上，本研究通过体内外实验证明了趋化因子XCL1可通过诱导CAR-T细胞和CD8+T细胞等免疫细胞的过度活化和迁移介导CRS的发生发展的作用，对进一步研究CRS具体机制及提供相应治疗靶点，具有重要的意义。