抗GPC3纳米抗体嵌合抗原受体修饰的T细胞抗肝癌作用及机制研究

The effectiveness of adoptive T-cell therapy of CAR-T cells targeting hepatocellular carcinoma needs to be improved.Nanobody is the smallest antigen-binding fragment,which show high temperature and pH stability, low immunogenicity, small molecular weight,excellent tissue distribution. Whether the tumor-penetrating of CAR-T cells can be promoted and the anti-tumor effect can be enhanced by using nanobody as extracellular domain need to be further studied .The GPC3 nanobody sequence(GPC3/Nb15),which was screened in the previous research,is used as an extracellular antigen recognition region to construct a novel CAR-T cell. First, The GPC3/Nb15 sequence was conjugated to human CD28, CD137 and CD3ζ to construct a chimeric antigen receptor, and the chimeric antigen receptor sequence was cloned into a lentiviral vector. The chimeric antigen receptor was transduced to T lymphocytes by lentivirus system to construct novel GPC3/Nb15-CAR-T cells.To investigate the anti-hepatocarcinoma activity and the possible mechanism of the novel CAR-T cells in vitro and in vivo. This project will provide a potential clinical value of CAR-T cell therapy on the hepatocellular carcinoma.

靶向肝癌的CAR-T细胞过继治疗的有效性有待提高。纳米抗体结构稳定、免疫原性小、分子量小、组织穿透力强，是最小的功能性抗原结合片段。利用纳米抗体作为胞外区构建CAR-T细胞，是否能促进CAR-T细胞的肿瘤组织穿透力，增强CAR-T细胞抗肿瘤效果有待研究。本项目拟在前期工作基础上，利用已筛选的GPC3纳米抗体（GPC3/Nb15）作为胞外抗原识别区，构建抗GPC3纳米抗体嵌合抗原受体修饰的新型CAR-T细胞并探讨其抗肿瘤作用及机制。把纳米抗体GPC3/Nb15序列与人CD28、CD137、CD3-ζ串联构成靶向GPC3嵌合抗原受体，通过慢病毒表达、转导构建新型靶向GPC3的GPC3/Nb15-CAR-T细胞。分别从体内外探讨GPC3/Nb15-CAR-T细胞的抗肝癌作用及可能机制。本项目建立一种治疗肝癌的新型CAR-T细胞，为肝癌免疫治疗提供了一条有潜在临床应用价值的新思路。

靶向肝癌的CAR-T细胞过继治疗的有效性有待提高。选择合适的肿瘤相关抗原作为靶标构建 CAR -T细胞，增强 CAR-T 细胞的亲和力和特异性，是提高 CAR-T 细胞过继免疫治疗效果，改善肝癌患者总体生存率的有效途径之一。磷脂酰肌醇蛋白聚糖 3 (glypican-3,GPC-3) ，参与 Wnts、Hedgehog(Hh)、成纤维细胞生长因子（FGF）等多条与肿瘤发生发展密切相关的信号通路，是肝癌靶向治疗新的靶点。纳米抗体结构稳定、免疫原性小、分子量小，组织穿透力强，是最小的功能性抗原结合片段。利用纳米抗体作为胞外区构建CAR-T细胞，是否能促进CAR-T细胞的肿瘤组织穿透力，增强CAR-T细胞抗肿瘤效果有待研究。课题组已构建纳米抗体筛选平台，本项目拟在前期工作基础上，开展了如下工作：1. 构建突变库筛选高亲和力纳米抗体。在前期实验中本课题组已经筛选出靶向结合GPC3的纳米抗体GPC3/Nb15，通过ELISA和流式细胞术实验验证，GPC3/Nb15纳米抗体特异性结合GPC3分子及高表达GPC3分子的肿瘤细胞。但是结合亲和力是影响治疗性抗体发挥作用的重要因素之一，提高抗体的亲力对于提高GPC3/Nb15-CAR-T细胞的治疗效果具有重要意义，抗体体外亲和力成熟是解决这一问题的重要途径。本课题选择基于抗体库的亲和力成熟策略：在预实验筛选获得的GPC3/Nb15纳米抗体序列的基础上，构建定向CDR重组库，利用噬菌体展示技术筛选出高亲和力抗体，并通过SPR亲和力测定、稳定性检测筛选生物活性最佳的纳米抗体进行后续研究。2. 使用最佳纳米抗体序列取代GPC3的scFv，包装GPC3纳米抗体-CAR慢病毒，构建GPC3纳米抗体嵌合抗原受体修饰GPC3/Nb-CAR-T细胞。3.体内、外检测GPC3/Nb-CAR-T细胞抗肝癌作用及机制。研究结果显示：GPC3/Nb-CAR-T细胞高分泌IL2、IFN-γ、TNF- α细胞因子，高特异性杀伤GPC3阳性肝癌细胞。在荷人肝癌小鼠模型中，GPC3/Nb-CAR-T细胞通过抑制血管生成、抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞的凋亡，延长荷瘤小鼠生存期。本项目的完成将提供一种新型 CAR-T 细胞治疗肝癌的新方法，为肝癌的免疫治 疗提供了一条有潜在临床应用价值的新思路。