用microarray技术和表达序列标签（EST）技术鉴定Bt水稻对稻田蜘蛛优势种群生存的影响

Bt toxin is a protein produced by the soil bacterium Bacillus thuringiensis and has been used for over 60 years as a biological pesticide for controlling lepidopteran pests. Due to its protein nature, Bt toxin is unstable and short lived under natural conditions, its use as a biological pesticide has been limited. With recent advances in molecular and transgenic technologies, Bt genes have been genetically engineered into crops and Bt protein successfully expressed for insect pest control. Although Bt proteins are considered relatively safe to non-target organisms, the potential long-term impact of Bt crops on non-target organisms is still a concern. Recent studies indicated that Bt protein could be enriched in the beneficial spider body via the food chain. This raises a serious question: could the enriched Bt protein in spiders inhibit or alter enzyme activities involved in gene expression and regulation, resulting in alternation of expression of other genes that might affect spider survivorship in the Bt rice field? To answer this question, we plan to (1) use cDNA microarray to analyze genome-wide gene expression profiles in two dominant rice field spider species (Pardosa pseudoannulata and Ummeliata insecticeps) between non-Bt and Bt spider groups; (2) to employ the SAM or RAM statistical methods and procedures to identify differentially expressed genes; (3) to identify the functions and signaling pathways of differentially expressed genes using the DAVID software; (4) to investigate the effects of Bt toxin on the genes involved in synthesis of spider toxin by constructing full-length cDNA libraries from the spider venom glands, by sequencing ESTs, and by bioinformatics analysis of ESTs. Results from the proposed research will help us to understand whether or not Bt protein affects spider populations via the food chain enrichment, therefore, providing a scientific basis for the safety evaluation of Bt crops.

随着近年分子与基因技术的进步，Bt蛋白基因已被转入农作物中并成功表达出了杀虫蛋白。尽管Bt蛋白被认为对于非靶标生物相对安全，但近期研究表明Bt蛋白可通过食物链富集在蜘蛛体内。这就面临一个严峻问题：富集的Bt蛋白在蜘蛛体内是否会抑制或改变基因表达调控酶而导致可能影响蜘蛛生存的其他基因表达的变化？为此我们提出这个计划：（1）使用cDNA microarray技术分析有无Bt蛋白胁迫下蜘蛛全基因组基因表达；（2）运用SAM或RAM统计方法和程序来检测在有无Bt蛋白胁迫下蜘蛛全基因组差异表达的基因；（3）利用DAVID软件对差异表达的基因进行功能分析和信号途径分析；（4）通过蜘蛛毒腺全长cDNA文库构建和EST测序分析，同时利用生物信息学手段，探讨Bt蛋白胁迫对蜘蛛毒素功能基因的影响。该方案的研究成果将有助于我们了解Bt蛋白是否通过食物链富集影响蜘蛛种群，由此为转Bt作物的安全性评价提供科学依据。

Bt蛋白可以从Bt水稻通过害虫传递并富集在拟环纹豹蛛体内，且不同龄期蜘蛛对Bt蛋白的富集能力不同。在蜘蛛体内，Bt蛋白则是通过蜘蛛消化系统进入血液，最后在肌肉组织中富集，并进入各亚细胞组织中。蜘蛛体内所富集的Bt蛋白对各亚细胞组织中解毒酶活性存在一定影响，主要包括AchE、SOD、POD、CAT、GSH-Px等。这些酶的酶活在不同亚细胞组织中发生不同程度的变化，但这些变化最终是否影响蜘蛛的安全有待进一步研究。. 另一方面，Bt蛋白对拟环纹豹蛛的基因表达水平有一定影响，蜘蛛体内不同组织、器官对Bt蛋白通过基因表达水平表现出不同的响应机制。对蜘蛛毒腺进行转录组测序，得到113358条unigene。基因功能预测显示有3726条unigene与刺激响应有关，720条unigene参与调控生物体免疫应答途径。对基因表达水平进行分析，发现有1724条基因差异表达，包括部分直接或间调控免疫或应激性的基因，如热激蛋白等。利用qPCR技术对这些差异基因表达水平进行了验证，结果与转录组结果一致。.对蜘蛛神经节进行转录组测序，获得120985条平均长度529.73的unigene。基因表达水平分析显示，Bt处理组蜘蛛体内有一类调控细胞能量代谢的基因相对于正常组显著差异表达，这在一定程度上解释了前期实验中Bt处理组蜘蛛搜寻范围增大的原因。. 对蜘蛛卵巢进行转录组测序分析，得到了8条卵黄蛋白合成相关的基因。且转录组分析和qPCR验证都表明，卵巢中这8条基因的表达水平没有受到Bt蛋白的影响。同时，个体水平上，雌蛛的繁殖参数包括产卵前期，产卵后期，产卵量，孵化率，卵囊营养成分等也没有显著性差异。这些表明，Bt蛋白对拟环纹豹蛛的繁殖力没有显著性影响。. 前期研究表明，Bt蛋白会使幼蛛的发育历期延长。对5龄幼蛛进行转录组分析，发现Bt处理组幼蛛相对于正常组有136个基因显著差异表达。功能分析显示，这些差异基因的生物学功能主要是调控蜘蛛体内几丁质，角质层的合成，代谢等，以及一系列氨基酸的代谢。这表明，Bt蛋白可能对幼蛛蜕皮期间新的角质层的形成有影响，这可能是导致幼蛛发育延迟的原因。