儿童急性淋巴细胞白血病中CREBBP介导的蛋白质乙酰化在调控CASP8AP2基因表达及白血病复发中的作用

Relapse is the main obstacle to improve long term disease-free survival of childhood ALL. Our previous study found that low expression of CREBBP and CASP8AP2 was associated with adverse prognosis and a positive correlation between their expression levels. Furthermore, two binding sites of CREBBP were found in the promoter region of CASP8AP2.?CREBBP was known to regulate target gene transcription by acetylating histone and transcriptional factor through histone acetyltransferase (HAT) activity; CREBBP and CASP8AP2 were involved in the regulation of cell cycle progression. We propose that CREBBP promote the CASP8AP2 transcription by acetylation of histone around the promoter region and transcriptional factor E2F3a, therefore the low expression of CREBBP could reduce the transcription of CASP8AP2 and affect the cell cycle progression, resulting in drug resistance and disease recurrence.?We intend to silent or overexpress CREBBP or its HAT deletion mutants, and then detect the acetylation level of histone and E2F3a by ChIP and Co-IP respectively, to verify that CREBBP promote CASP8AP2 transcription by its HAT domain; and detect the cell cycle, proliferation and apoptosis by flow cytometry with or without the drug treatment to clarify the mechanism of relapse initiated by CREBBP and CASP8AP2 low expression. It will be helpful to provide a novel therapeutic target to further improve the prognosis of childhood ALL.

复发是影响儿童ALL长期无病生存的主要因素。我们前期研究发现，CREBBP和CASP8AP2表达呈正相关，且低表达均与复发相关；后者启动子区有CREBBP结合位点。已知CREBBP经组蛋白乙酰基转移酶(HAT)活性乙酰化组蛋白和转录因子来调控靶基因转录；CREBBP和CASP8AP2均参与调控细胞周期进展。由此推测，CREBBP通过增强CASP8AP2启动子区组蛋白和转录因子E2F3a乙酰化促进CASP8AP2转录，其低表达导致CASP8AP2表达降低，细胞周期减慢，造成白血病耐药和复发。拟提高或降低CREBBP表达、转染HAT缺失突变体，通过ChIP、Co-IP分别检测组蛋白、E2F3a乙酰化水平，证明CREBBP经HAT活性促进CASP8AP2表达；通过FCM检测细胞周期、药物作用后细胞增殖与凋亡情况，阐明CREBBP和CASP8AP2低表达导致复发的机制，为改善ALL疗效提供新靶点。

复发是影响儿童急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia, ALL）长期无病生存的主要因素，因此找到复发相关分子，并阐明其导致复发的机制，可为今后ALL疗效的提高提供参考。本项目发现，组蛋白乙酰基转移酶CREBBPmRNA表达水平与患者预后相关。我们检测了349例ALL患儿初诊和其完全缓解后的骨髓样本，并利用3例正常人的骨髓样本作为对照。结果显示，97.7%的患儿初诊样本中，CREBBP表达低于正常人，而其缓解后的骨髓样本中表达水平显著升高。利用ROC曲线的方法，将患者分为CREBBP高低表达两组，其中低表达者与强的松反应不佳，诱导治疗结束时高微小残留病水平显著相关。此外，我们还发现无论应用何种化疗方案，CREBBP低表达者5年无事件生存率（EFS）和总生存率（OS）显著低于高表达者，在BCH-2003治疗组中，还被证实是独立预后因素。而在CCLG-2008治疗方案中，在应用了高强度化疗方案的CREBBP低表达者， 5年EFS和OS明显高于应用低强度化疗方案者。由此提示，CREBBP可能通过影响白血病细胞对化疗药物的敏感性影响预后。我们通过过表达或敲减CREBBP基因，以及应用CREBBP蛋白激动剂或抑制剂来改变白血病细胞系Jurkat和Reh中CREBBP的表达水平或者组蛋白乙酰化酶活性，结果显示增强CREBBP活性可使细胞凋亡增多，细胞周期阻滞于G2/M期，增殖降低；同时可增强白血病细胞对常用化疗药物的敏感性，包括柔红霉素、长春新碱、左旋门冬酰胺酶。在此基础上，本研究进一步探讨了CREBBP影响白血病细胞周期进展的分子机制，结果显示CREBBP可与CASP8AP2基因启动子区相结合，并与细胞周期调控因子E2F3蛋白具有相互作用和细胞内的共定位，而E2F3也是CASP8AP2的转录因子；CASP8AP2基因表达水平与CREBBP的表达水平正相关，与其活性正相关，因此CREBBP可通过直接和间接两条途径调节CASP8AP2基因表达。本研究的发现，阐明了CREBBP功能不足可以降低白血病细胞对化疗药物的敏感性，从而导致患者复发，并且在应用CREBBP激动剂后，白血病细胞对主要化疗药物的敏感性显著增加。这些发现，为今后临床研发和使用针对CREBBP的小分子药物治疗ALL提供了临床依据及基础理论支持。