柞蚕神经肽PBAN的受体鉴定及其作用的信号转导分析

昆虫性信息素合成激活肽(PBAN) 的主要功能是调节雌蛾性信息素的合成和释放，控制昆虫的交配繁衍继代,但其调控性信息素合成的信号通路存在2种不同观点。本项目拟开展柞蚕神经肽PBAN受体鉴定及其作用的信号转导研究。克隆柞蚕PBAN受体基因，构建质粒，转染合适的细胞株后鉴定PBAN受体。制备PBAN模拟肽（mimetic peptides），鉴定其与受体的作用及生理活性。解剖性腺与PBAN体外培养，利用钙离子及其通道阻断剂和载体、cAMP、毛喉素等调控性信息素的合成，明确柞蚕PBAN作用信号的第2信使。利用Solexa 高通量测序的方法测定不同组织转录组，明确性腺特异表达基因。利用RNAi或其他方法鉴定PBAN调控性信息素合成的关键基因。本研究结果有助于深入了解PBAN 调节性信息素合成的精确机制，为有效地控制害虫和调节益虫饲养建立基础；也为研究其他昆虫神经肽基因的受体及信号转导建立基础。

昆虫性信息素合成激活肽(PBAN) 的主要功能是调节雌蛾性信息素的合成和释放，控制昆虫的交配繁衍继代。本项目克隆了柞蚕神经肽PBAN受体基因（Anp-PBANR），Anp-PBANR基因的ORF为1038bp，编码345个氨基酸，ORF编码的蛋白具有G蛋白偶联受体典型特征，具有7个跨膜蛋白结构域（TM）。把Anp-PBANR的ORF插入到PcDNA5-FRT载体中，转染细胞株后与PBAN进行结合反应，Ca2+反应明显，剂量效应为EC50=0.003uM。合成PBAN的C端9个氨基酸（RTRYFSPRLa，命名为AP1），AP1与Anp-PBAN受体的结合反应与PBAN几乎相当，再分别去除F、S、P、R、L氨基酸，结合反应后证明FSPRL关键氨基酸对与PBAN受体的结合活性影响顺序为去酰胺化>L>R>F>P>S。采取不同的修饰方法进一步合成31种模拟肽，[Aib-Aib-Aib-Aib]FTPRLa的结合活性最高，达到AP1的65.59%，结合活性达到AP1的50%以上的还有5种。建立柞蚕性腺体外培养体系，PBAN培养后可以显著提升柞蚕性信息素的主要成分反-6,顺-11-十六碳二烯醋酸酯 (E-6,Z-11-I6:Ac)的合成。Ca2+载体A23187和离子霉素能够显著提升信息素的合成，而cAMP几乎没有影响，说明柞蚕PBAN调控信息素的合成是通过Ca2+信号转导通路。在转录组分析基础上，筛选出17个与性信息素合成与代谢相关的基因；其中Acetyl CoA Carboxylase等8个基因主要在性腺中特异高表达。根据转录组结果和家蚕和棉铃虫性信息素通路的报道，预测了柞蚕性信息素合成的通路。RNAi研究结果显示抑制柞蚕PBAN受体、去饱和酶、脂肪酶和酰基辅酶A结合蛋白后，柞蚕信息素合成显著降低，表明这4种基因参与调控柞蚕信息素的合成。上述研究成果，为我们进一步研究其它昆虫其它神经肽基因的受体建立了基础，为我们利用G蛋白偶联受体筛选活性模拟肽、开发新型昆虫生长调节剂建立了平台。本项目已经发表论文5篇，其中SCI期刊2篇；目前还有2篇SCI文章待发表。