柞蚕核型多角体病毒细胞凋亡抑制蛋白的鉴定及其功能分析

细胞凋亡被认为是昆虫抵抗病毒侵染的一个重要防御机制，杆状病毒细胞凋亡抑制蛋白(IAP)在昆虫细胞的凋亡与其被抑制的过程中起着极其重要的作用，但其作用的特异性靶分子蛋白及机理仍不清楚。柞蚕是我国特有的一个重要经济昆虫，由于受到柞蚕核型多角体病毒(ApMNPV)的侵染，其生产的产量和质量受到直接影响。ApMNPV属杆状病毒科，已知其病毒基因组编码两个可能的细胞凋亡抑制蛋白(Ap-IAP1和Ap-IAP2)，但我们对它们的性质和功能以及柞蚕抗病毒防御机制一无所知。本项目通过体外酶活性分析、体内Ap-iap基因的RNAi干扰、细胞凋亡功能互补试验及基因缺失等方法鉴定这两个蛋白质在抑制细胞凋亡过程中的作用，并将杆状病毒表面展示技术用于蛋白质-蛋白质间相互作用的研究中，为确定柞蚕杆状病毒IAP蛋白所作用的特异性靶分子蛋白提供线索。同时，初步探讨细胞凋亡在柞蚕抗病毒防御中的作用，为柞蚕抗病育种提供依据。

杆状病毒细胞凋亡抑制蛋白(IAP)在调节细胞凋亡的过程中起着重要的作用，但其作用的靶分子蛋白及机理仍不清楚。柞蚕是我国特有的经济昆虫，受到柞蚕核型多角体病毒(ApMNPV)的危害，其产量和质量受到直接影响。ApMNPV基因组编码两个可能的细胞凋亡抑制蛋白(Ap-IAP1和Ap-IAP2)，我们对它们的性质、功能及在柞蚕抗病毒防御机制上的作用不了解。本课题通过体外蛋白质相互作用、昆虫细胞内瞬时表达、体内基因干扰及基因缺失等方法分析这两个蛋白质在抑制细胞凋亡过程中的作用。实验结果表明：原核表达的Ap-IAP1和Ap-IAP2都具有蛋白质结合特性。Ap-iap1 基因在TnHi-5细胞中瞬时表达能抑制放线菌素D诱导caspase蛋白酶活性，Ap-iap2 基因在Sf21细胞中瞬时表达能抑制放线菌素D诱导caspase蛋白酶活性。首次发现ApMNPV能够感染TnHi-5细胞，并抑制放线菌素D诱导细胞凋亡。RNAi方法证实干扰Ap-iap1基因表达能降低ApMNPV抑制细胞凋亡的作用，同时降低Ap-iap2和DNA pol 基因转录表达。干扰Ap-iap2基因表达也能降低Ap-iap1和DNA pol 基因的转录表达。基因差异表达结果显示Ap-iap1基因在AcMNPV中表达会使病毒部分基因转录水平提高，降低细胞部分基因转录；Ap-iap2基因在AcMNPV中表达主要使细胞的部分基因转录水平下降。缺失Ap-iap1或Ap-iap2基因的ApMNPV仍具有感染性。根据上述结果，我们认为Ap-IAP1在ApMNPV抑制细胞凋亡中起主要作用，Ap-IAP2参与ApMNPV抑制细胞凋亡。Ap-IAP1和Ap-IAP2功能不同，但它们有一定的关联性，并共同影响DNA pol基因表达。Ap-iap1和Ap-iap2基因是ApMNPV非必需基因，缺失Ap-iap1或Ap-iap2基因可能影响病毒在柞蚕中的感染和复制。本课题系统地分析了Ap-IAP1和Ap-IAP2的特性及在抑制细胞凋亡中的作用，同时发现它们在病毒感染复制中的作用，并为进一步分析其作用对象提供了线索。为今后深入研究柞蚕抗病毒机制，开展柞蚕抗病育种提供了依据。.围绕课题总体目标，我们按计划执行，虽然部分研究内容有所调整，但更多的是增加了研究内容，达到了主要研究目的。最后小部分探索性的研究工作也是按计划进行，结果有待分析。