大蒜果聚糖水解酶的结构及其对大蒜保鲜处理反应规律的研究

我国是世界上最大的大蒜生产与消费国。大蒜果聚糖（GF）是大蒜的主要贮存物质，占大蒜干重的75％以上。探明大蒜果聚糖水解酶(GFEH)是控制GF水解、稳定GF质量、抑制保鲜大蒜生芽等品质劣变的关键。国外尚未见GFEH的报道。据研究推测：GFEH应当对温度、气调、辐射等大蒜保鲜处理有规律性反应。本项目拟研究GFEH分子结构、酶学特征等基础科学问题，并证实上述推测。先以不同保鲜大蒜为试材，用亲和层析、双向电泳等多种分离纯化技术获得GFEH纯品，再用生物质谱、核磁共振、原子力显微镜、园二色谱、cDNA克隆与测序等技术研究GFEH的分子结构和基因序列，并研究该酶的催化机理、活力中心等酶学特征及其对低温、气调、辐射等大蒜保鲜处理反应的规律。本研究是食品、生物化学、分子生物学等学科的交叉研究；对丰富和拓展酶学、糖代谢、生物技术理论，对生产高品质GF、提高大蒜贮存保鲜效果、改善大蒜种质等实践均有重要意义

首先研究了大蒜(Allium sativum L.)果聚糖水解酶(FEH)的酶学特征。采用硫酸铵分级沉淀确定FEH 所在的沉淀部位，采用薄板层析和离子色谱法研究酶解产物，通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定还原糖的变化量计算酶活力，进而研究 FEH 的酶切位点等。结果表明大蒜FEH存在于 0～20% 硫酸铵饱和度部位，根据酶解产物判断该酶属于外切酶，最适反应温度为45℃，最适反应pH值5.5，最适离子强度为1.5mol/L氯化钠，最适反应质量浓度为4mg/mL。其次，采用PCＲ和ＲACE的方法，获得FEH基因的全长cDNA序列，并对其基因结构和系统进化进行分析。结果表明，所获得的cDNA序列全长1900bp，开放阅读框(OＲF)为1668bp，编码555个氨基酸。在该氨基酸序列中发现已知FEH氨基酸序列的保守功能域；与小麦(Triticum aestivum)、黑麦(Lolium perenne)的FEH氨基酸序列的同源性为53%。基本确定首次获得了大蒜FEH基因。另外，还研究了与FEH相关的底物即大蒜中果聚糖的益生元、抗辐射等功能性质。